ZNAJDŹ LEKARZA

środa, 19 Wrzesień 2018 Wersja beta
Zobacz:

Charakterystyka morfologiczna i czynnościowa komórek ludzkiego nabłonka łączącego dziąseł

Nabłonek dziąsła dzieli się na trzy regiony: nabłonek zewnętrzny dziąsła (OGE), nabłonek wewnętrzny dziąsła, inaczej nabłonek rowka dziąsłowego (SE), i nabłonek łączący (JE). JE jest wyspecjalizowanym rodzajem nabłonka, znajdującym się na styku tkanki twardej zęba i tkanek miękkich przyzębia, przylegającym do korony albo korzenia na podobieństwo kołnierzyka. Komórki JE mają jednolite ukształtowanie (albo płaskie, albo wrzecionowate) i ułożone są równolegle do powierzchni zęba, tworząc duże przestrzenie międzykomórkowe z powodu luźnych połączeń międzykomórkowych [1]. Jako szczególna struktura na styku zęba i przyzębia JE różni się od innych nabłonków (OGE, SE) pod względem pochodzenia, morfologii komórek, proliferacji i różnicowania [2, 3]. Doniesiono, że nabłonek łączący odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu integralności tkanek przyzębia [4, 5] i jest obszarem o szczególnym znaczeniu dla rozwoju i leczenia chorób przyzębia [6]. Ponadto wykryto w nim obecność defensyn neutrofilowych, mających znaczący wpływ na jego integralność i czynność (adhezja keratynocytów, wzrost i proliferacja), który to wpływ nie wynika z aktywności przeciwbakteryjnej owych substancji [7]. Jednakże nadal niejasne i kontrowersyjne pozostają kwestie różnicowania JE, aktywności fagocytarnej, mechanizmu jego przylegania do powierzchni zęba, mechanizmów naprawy i odbudowy po urazie [5, 8]. 

Konwencjonalne metody histologiczne badania JE in vivo cechują się nazbyt uproszczonym podejściem i ograniczonym zakresem obserwacji [9-12]. W ostatnich latach badano nabłonek łączący, posługując się modelami hodowli in vitro i technikami cytologii molekularnej, z wykorzystaniem zwierzęcych i/lub ludzkich komórek OGE, komórek więzadła okrężnego zęba i komórek nabłonka jamy ustnej [13-16]. Chociaż te komórki wchodzą w skład nabłonka jamy ustnej, nie mogą w pełni odwzorować podstawowych cech JE z powodu odmienności w źródle, morfologii, strukturze, różnicowaniu i charakterze bodźców wywołujących proliferację.

Cytokeratyny (CK) są rodziną białek należących do pośrednich filamentów cytoszkieletu i będących głównymi białkami strukturalnymi komórek nabłonka. Jak wiemy, ekspresja keratyn jest jedną z definitywnych cech komórek nabłonka i odzwierciedla ich biologiczne właściwości, w tym: pochodzenie, rozwój, typ histologiczny i poziom zróżnicowania [17, 18]. W kilku pracach badano ekspresję i dystrybucję CK (CK-pan, 5/6, 7, 8/18, 10/13, 16, 17, 19, 20) w tkankach okołozębowych ludzi i zwierząt, i określono ekspresję niektórych keratyn w nabłonku dziąseł [15, 19-21]. Na przykład ekspresja CK 10/13, 16, 19 w JE była inna niż w OGE i SE. Szczególnie wysoka ekspresja CK 19 we wszystkich warstwach JE stała się charakterystycznym markerem histologicznym JE in vivo [3, 22-24]. Jednak nie pojawiały się systematyczne doniesienia o ekspresji różnych typów cytokeratyn w JE i różnicy pomiędzy nimi a OGE i SE.

W publikowanej pracy oceniono charakterystyczne cechy morfologiczne JE za pomocą badań histologicznych i immunohistochemicznych. Ustalono ekspresję i rozkład typów CK w tkance JE i porównano z OGE i SE. Ponadto założono hodowlę pierwotnych komórek JE i OGE, w której prowadzono obserwację struktury morfologicznej i wzorca wzrostu głównego oraz oceniono metodami immunohistochemicznymi ekspresję określonych cytokeratyn (CK-pan, 19, 10/13, 16). Przypuszczamy, iż udało nam się zidentyfikować jedyne w swoim rodzaju biologiczne właściwości JE (morfologia, potencjał regeneracyjny) in vivo i in vitro. Prócz tego wyhodowane komórki JE posiano bezpośrednio na wycinki korzeni zębów w hodowli założonej w celu zbadania procesu tworzenia nowych połączeń przez JE. Wyniki powinny dostarczyć podstaw do dalszych badań nad tworzeniem się nowych połączeń po zabiegach w obrębie przyzębia oraz nad gojeniem się tkanek po wszczepieniu implantów.

METODY

Cechy morfologiczne ludzkiego nabłonka dziąseł

Próbki tkanki dziąseł pobrano z żuchwy 6 pacjentów (4 mężczyzn i 2 kobiet) operowanych z powodu szkliwiaka żuchwy, niepalących i bez żadnych innych schorzeń. Wiek i miejsce pobrania wyszczególniono w tab. 1. Zabiegi przeprowadzono na Oddziale Patologii Jamy Ustnej Szpitala Uniwersyteckiego w Szanghaju pomiędzy wrześniem a październikiem 2010 r. Lokalny komitet etyczny zaakceptował projekt badania, a od wszystkich pacjentów uzyskano poinformowaną zgodę. Od każdego pobrano 1 ząb trzonowy lub przedtrzonowy spoza obrębu guza, wraz z tkankami dziąsła, o głębokości kieszonek dziąsłowych (zmierzonej sondą) < 3 mm. Próbki utrwalono w 10-proc. roztworze formaliny w temperaturze pokojowej przez 24 h, po czym umieszczono w roztworze odwapniającym Plank-Rychlo (70 g AlCl3, 56 ml kwasu mrówkowego, 85 ml kwasu solnego, woda destylowana do 1 l) na 2 tygodnie, a następnie pocięto piłą ręczną zgodnie z długą osią zęba wzdłuż powierzchni policzkowo-językowej. Ostatecznie z każdego okazu zęba uzyskano kilka wycinków grubości 5 mm. Wycinki poddano odwodnieniu za pomocą etanolu i zatopiono w parafinie. Z każdego okazu wybrano losowo 3 bloczki i pocięto na preparaty grubości 4 μm, które zabarwiono hematoksyliną-eozyną (HE) i oglądano pod mikroskopem świetlnym, oceniając szerokość, grubość i powierzchnię JE oraz szerokość SE od strony policzkowej za pomocą systemu analizy obrazu Axioplan 2.

Z uwagi na oddzielenie JE od powierzchni zęba po odwapnieniu, granicę między JE i SE ustalono na podstawie przebiegu rąbka nabłonka, cech keratynizacji, morfologii komórek i obrazu po wybarwieniu. Zgodnie z metodą projekcji wykreślono pionowe linie w kierunku powierzchni zęba od wolnego brzegu SE, styku JE i SE oraz najdalszego korzeniowego odcinka JE. Długości linii biegnących od SE i JE do powierzchni zęba zostały przyjęte jako szerokość odpowiednich typów nabłonka. Przez najgrubszy odcinek JE została przeprowadzona prostopadła linia, odległość między dwoma punktami jej przecięcia z nabłonkiem przyjęto jako grubość JE. Następnie wykreślono krzywą od najdalszego korzeniowego odcinka JE do jego połączenia z SE, obliczając na tej podstawie powierzchnię JE (rys. 1).

Hodowla ludzkich komórek JE i OGE

W celu uzyskania hodowli komórek JE i OGE in vitro od zdrowych młodych osób (12-25 lat) bez chorób przyzębia pobrano 5 zdrowych zębów wymagających ekstrakcji z powodów ortodontycznych. Zęby usunięto wraz z 2-milimetrowym marginesem dziąsła przy powierzchni policzkowej i językowej. Odpreparowano wolne dziąsło (w tym OGE i SE), na ile było to możliwe makroskopowo. Z szyjki (nie z korzenia) zęba zeskrobano tkanki JE mocno przylegające do powierzchni zęba (fot. 1) i przemyto roztworem D-Hanka, zawierającym penicylinę i streptomycynę. Protokół naukowy został zatwierdzony przez komitet etyczny Szpitala Zhongshan (nr: 2009-173).

W hodowli wyjściowej tkanki JE nadtrawiano 2 ml roztworu Dispase II w 4°C przez 16-18 godzin. Nabłonek oddzielono od blaszki właściwej za pomocą kleszczyków, a następnie pocięto na kawałki, które trawiono 4 ml roztworu 0,025-proc. trypsyny z 0,01-proc. EDTA przez 5-8 minut, mieszając. Trawienie zakończono, dodając roztwór D-Hanka zawierający 10-proc. FBS, po czym przefiltrowano przez sito ze stali nierdzewnej 180 μm, a następnie odwirowano. Do precypitatu dodano pożywkę stymulującą wzrost keratynocytów DKGM, uzyskując zawiesinę komórkową, którą posiano na 24-dołkowe płytki (2 × 105 komórek/ml) i umieszczono w inkubatorze w 37°C w atmosferze 5-proc. CO2. Pożywkę odświeżono po raz pierwszy po 3 dniach, następnie raz dziennie. Komórki pasażowano przy konfluencji 60-70%, dodając roztwór 0,25-proc. trypsyny z 0,02-proc. EDTA w 37°C na 5-8 min. Gdy pod mikroskopem komórki przybierały kształt okrągły, kończono nadtrawianie, po czym odwirowywano mieszaninę. Następnie dodawano DKGM w celu ponownego utworzenia zawiesiny komórkowej i wysiewano do nowych płytek Petriego. Analogicznie postępowano z komórkami OGE, z tą różnicą, że tkankę pocięto na skrawki 5 mm2 × 5 mm2, a zawiesinę wysiewano z gęstością 5-10 × 105 komórek/ml do płytek Petriego śr. 60 mm. Hodowane komórki codziennie oglądano w mikroskopie fazowo-kontrastowym, by śledzić ich morfologię i warunki wzrostu. Zawiesinę pojedynczych przepasażowanych komórek wysiewano z gęstością 2-5 × 105 komórek/ml na szkiełkach nakrywkowych w sterylnych płytkach Petriego, po czym po osiągnięciu 60-proc. konfluencji barwiono HE i oglądano pod mikroskopem świetlnym w celu śledzenia zmian ich morfologii i struktury.

Krzywa wzrostu komórek JE i OGE

Wyjściowe komórki JE i OGE przy 100-proc. konfluencji nadtrawiano, by uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek, i wysiewano z gęstością 2 × 104/cm2 na 24-dołkowe płytki. Codziennie za pomocą hematocytometru zliczano komórki z dwóch losowo wybranych dołków. Krzywą wzrostu komórek wykreślano, nanosząc średnie wartości liczby komórek każdego dnia. Czas podwojenia wyliczano na podstawie krzywej wzrostu, która wskazywała, jaki odstęp czasu jest konieczny dla podwojenia liczby komórek w fazie wykładniczej.

Immunohistochemiczna analiza tkanki nabłonkowej ludzkich dziąseł i komórek z hodowli in vitro tkanki nabłonkowej ludzkich dziąseł i komórek z hodowli in vitro

Reakcję immunohistochemiczną z koniugatem peroksydaza-streptawidyna (SP) przeprowadzono na ludzkiej tkance dziąseł przez inkubację z przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko ludzkim cytokeratynom: Anti-CK 5/6 (klon D5/16B4), anti-CK 7 (OV-TL 12/30), anti-CK 8/18 (klon Zym5.2), anti-CK 10/13 (klon DE-K 13), anti-CK 16 (klon LL025), anti-CK 17 (klon E3), anti-CK 19 (klon A53/BA2) i anti-CK 20 (klon Ks20.8), produkcji Zymed (USA). Jako kontrolę dodatnią zabarwiono tkankę ludzkiego gruczołu ślinowego [25], a jako kontrolę ujemną – przeciwciało pierwszorzędowe zastąpiono PBS. Wybarwianie przeprowadzano wg instrukcji producenta przeciwciał. Odparafinowane wycinki inkubowano z roztworem pepsyny w 37°C przez 5-10 min, a następnie z surowicą blokującą w temperaturze pokojowej przez 30 min. Przeciwciało pierwszorzędowe w rozcieńczeniu 1 : 50 dodawano do preparatów badanych i kontroli dodatniej, zastępując je PBS w kontroli ujemnej. Po inkubacji w 4°C przez całą noc wycinki inkubowano z roztworem przeciwciała drugorzędowego znakowanego biotyną przez 30 min w temperaturze pokojowej, a następnie z roztworem peroksydazy z korzenia chrzanu znakowanej streptawidyną, również w temperaturze pokojowej. Po 5-10 min dodawano substrat chromogenny DAB. Wycinki przepłukiwano pod bieżącą wodą, ponownie barwiono hematoksyliną i przygotowywano preparat. Przepasażowane komórki przylegające do szkiełek nakrywkowych utrwalano 10-proc. obojętnym roztworem formaliny, a następnie postępowano z nimi jak z tkankami JE. W tych komórkach wykryto CK-Pan, CK 19, CK 10/13 i CK 16. Cytoplazmę komórek CK-dodatnich wybarwiono, klasyfikując reakcję jako negatywną (-) przy braku wybarwienia, słabo dodatnią (+) przy wybarwieniu żółtawym, umiarkowanie dodatnią (++) przy wybarwieniu żółtym albo silnie dodatnią (+ + +) przy wybarwieniu brązowym [26].

Hodowla mieszana ludzkich komórek JE i skrawków korzenia

Skrawki korzenia uzyskano z tych samych próbek co wyjściowe komórki JE. Próbki oczyszczono z resztek ozębnej za pomocą kirety Grace i utrwalano w 10-proc. roztworze formaliny w temperaturze pokojowej przez 12 h, po czym umieszczono w roztworze odwapniającym Plank-Rychlo na 2 tygodnie. Korony zębów usunięto, a korzenie pocięto wzdłuż osi długiej na skrawki o powierzchni 5 × 5 mm2 i grubości 1-1,5 mm. Skrawki przemyto i moczono przez 2-3 dni w roztworze D-Hanka z penicyliną i streptomycyną w 4°C. Następnie próbki umieszczono na 24-dołkowej płytce – 2-3 skrawki na dołek – i posiano na nie od strony zębiny zawiesinę przepasażowanych komórek JE z gęstością 5 × 105 komórek/ml; hodowlę inkubowano przez 14 dni w 37°C w wilgotnym środowisku w atmosferze 5-proc. CO2. Pożywkę odświeżono po raz pierwszy po 3 dniach, następnie raz dziennie.

Badanie w transmisyjnym mikroskopie elektronowym (TEM)

Skrawki korzeni pobierano 3, 5, 7, 9, 11 i 14 dni po założeniu hodowli i utrwalano 2-proc. glutaraldehydem w 4°C przez 2 h. Skrawki układano tak, by zębina znajdowała się na powierzchni, i cięto na fragmenty 5 × 1 × 1 mm, następnie utrwalano powtórnie 1-proc. kwasem osmowym w 4°C przez 2 h, odwadniano etanolem, namaczano w tlenku propylenu w temp. pokojowej na 24 h i zatapiano w żywicy epoksydowej. Następnie próbki cięto na ultracienkie skrawki, barwione cytrynianem ołowiu, i oglądano w TEM (CM-120, PHILIPS) w celu prześledzenia procesu przyłączania komórek JE do powierzchni zębiny.

WYNIKI 

Analiza morfologiczna tkanki nabłonkowej ludzkich dziąseł

Pod mikroskopem komórki JE były krótkie i pasmowate, stając się coraz grubsze na przestrzeni od styku zębiny i szkliwa do korony. Po zabarwieniu HE nie stwierdzano keratynizacji ani rąbka nabłonkowego w tkance JE, która dzieliła się na warstwę podstawną i ponadpodstawną, podczas gdy w ciemno wybarwiających się tkankach SE i OGE widoczny był nabłonek rogowaciejący lub częściowo rogowaciejący oraz zwarte, nieregularne rąbki nabłonka sięgające w przylegającą tkankę łączną (fot. 2). Ponadto komórki JE różniły się od SE i OGE morfologią i były wyraźnie odgraniczone od SE (fot. 2 B). Komórki w tkance JE były jednolitego kształtu, płaskiego lub wrzecionowatego, układały się równolegle do powierzchni zęba, tworząc luźne połączenia międzykomórkowe z widocznymi przestrzeniami międzykomórkowymi. Natomiast komórki SE i OGE miały kształt nieregularnych wielokątów i ściśle przylegały do siebie, pozostawiając mniejsze (lub niewidoczne) przestrzenie międzykomórkowe. Ponadto komórki JE obfitowały w organelle i miały duże jądra; jądra komórek SE i OGE były również duże, lecz hiperchromatyczne. Komórki SE i OGE wykazywały typowe cechy strukturalne nabłonka wielowarstwowego i mogły przechodzić jedne w drugie bez wyraźnych granic.

Zgodnie z pomiarami dokonanymi przy analizie obrazu tkanka JE wykazywała szerokość 1,021 mm ± 0,128 mm (podczas gdy SE 0,532 mm ± 0,176 mm), grubość 0,066 mm ± 0,009 mm i powierzchnię 0,042 mm2 ± 0,002 mm2 (tab. 1).

Analiza morfologiczna komórek JE i OGE tkanki nabłonkowej ludzkich dziąseł w hodowli in vitro

W celu precyzyjnego scharakteryzowania cech komórek JE i OGE założono ich hodowlę in vitro. Wyjściowe komórki JE wykazywały różnoraką morfologię (płaskie wielokątne, wrzecionowate, owalne i kuliste). Po 24-96 h inkubacji komórki przywierały do dna płytki Petriego, cytoplazma przybierała ciemną barwę, błona komórkowa była szorstka, 2-3-krotnie większa liczba komórek była w pełni spłaszczona. Jądra były duże i na ogół miały od 2 do 3 jąderek. Po 7 dniach komórki stopniowo wchodziły w fazę szybkiego wzrostu i rozrastały się na płytkach Petriego w kierunku dośrodkowym. Na fot. 3 A widoczne są klony komórkowe o kształcie graniastym lub wrzecionowatym i rozsiane podziały mitotyczne. Po 10-12 dniach klony komórkowe o różnorakiej morfologii i wielkości tworzyły zwarte skupiska (fot. 3 B). Po pierwszym przepasażowaniu komórki przywierały do dna płytki i spłaszczały się w ciągu 24-48 h od posiania, przyjmując podobną morfologię jak komórki wyjściowe; po drugim przepasażowaniu komórki JE wykazywały nieregularne kształty z pseudopodiami na podobieństwo komórek olbrzymich oraz wakuolizację cytoplazmy (fot. 3 C); w miarę dalszego pasażowania kształty stawały się bardziej nieregularne, a tempo proliferacji malało, niekiedy wykazując oznaki starzenia i obumierania (fot. 3 D).

Wyjściowe komórki OGE miały kształt wielokątny albo kulisty i przywierały do dna płytki w ciągu 24-72 h; po 5 dniach powstawały klony komórkowe o kształcie trójkątnym albo wielokątnym, bardziej jednolite niż klony komórek JE po takim samym czasie (fot. 3 E); po 7-9 dniach klony OGE powiększały się i skupiały, wiążąc się ze sobą ściśle i wykazując typową keratynizację o wyglądzie „kostki brukowej” (fot. 3 F); po 9-11 dniach uzyskiwno 100-proc. konfluencję. Po drugim przepasażowaniu komórki przywierały i rozprzestrzeniały się w ciągu 48 h, a następnie pojawiały się „komórki olbrzymie” (fot. 4 G); po 4 przepasażowaniu w hodowli znajdowały się głównie „komórki olbrzymie”, proliferacja zwalniała, pojawiały się oznaki starzenia i obumierania (fot. 3 H).

Następnie komórki JE i OGE barwiono HE i oglądano pod mikroskopem. Komórki JE wykazywały zmienną morfologię (wrzecionowate, trójkątne, owalne), niejednolite rozmiary, luźny układ, duże ciemno zabarwione jądra i liczne podziały, podobnie jak podawano powyżej (fot. 4). Za to komórki OGE były jednakowej wielkości, ciasno skupione, zwykle skeratynizowane, z okrągłymi centralnie umieszczonymi jądrami, również w nich widoczne były podziały (fot. 4 B).

Analiza wzrostu komórek JE i OGE hodowanych in vitro

Hodowla zawierała więcej komórek OGE w porównaniu do JE. Toteż okres inkubacji konieczny dla uzyskania przylegania do podłoża i namnażania in vitro komórek JE wynosił 1-7 dni, podczas gdy dla komórek OGE był krótszy, 1-3 dni. Faza wykładnicza i szczyt wzrostu komórek JE następowały pomiędzy 8 a 12 dniem (trwając tylko przez 5 dni), podczas gdy dla OGE był to okres między 4 a 11 dniem (i trwał 8 dni). Po 12 dniach jedne i drugie komórki wchodziły w okres stacjonarnego wzrostu. Liczba komórek JE wzrosła od 6 × 104/ml do 12 × 104/ml w ciągu 9-12 dni, zaś OGE z 7 × 104/ml do 14 × 104/ml w ciągu 6-10 dni. Zgodnie z obliczeniami statystycznymi czas podwojenia populacji komórek JE wynosił 48-60 h, podczas gdy OGE – 72-96 h. Generalnie krzywa wzrostu OGE wykazywała łagodniejszy przebieg niż JE (rys. 2). Jak pokazuje fot. 5, komórki JE udało się z powodzeniem przepasażować 5-krotnie, zaś OGE 7-krotnie. Jakość przepasażowanych komórek JE dramatycznie pogarszała się po 3 pasażowaniu, a OGE po 4.

Analiza immunohistochemiczna komórek JE i OGE tkanki nabłonkowej ludzkich dziąseł w hodowli in vitro

W celu głębszego zbadania charakterystyki czynnościowej komórek JE określono ekspresję kilku cytokeratyn. W tkance nabłonkowej ludzkich dziąseł ekspresja CK 5/6 i CK 20 była podobna, choć CK 5/6 wybarwiała się silniej. Pozytywne wybarwienie występowało w warstwie ponadpodstawnej (szczególnie blisko powierzchni), zaś negatywne w warstwie podstawnej. Ekspresja CK 7 i CK 17 była dodatnia albo słabo dodatnia w bardzo nielicznych komórkach. Ekspresję CK 10/13 (silnie dodatnią) i CK 16 (słabo dodatnią lub dodatnią) wykryto we wszystkich warstwach JE, za to tylko w warstwie ponadpodstawnej OGE i SE. CK 19 znajdowano we wszystkich warstwach JE z silnie dodatnią ekspresją, podczas gdy w OGE i SE jedynie w warstwie ponadpodstawnej. Granica między JE a SE była wyraźnie widoczna z powodu różnicy w ekspresji CK 19. Ekspresja CK 8/18 wykazywała poziom podobny do CK 19, z tym, że w OGE i SE dodatnia była głównie w warstwie podstawnej, a także słabo dodatnia w niektórych komórkach warstwy ponadpodstawnej (blisko podstawnej). Szczegóły zawarte są w tab. 2 i na fot. 6.

W hodowli zarówno komórki JE, jak i OGE wybarwiały się dodatnio na obecność CK-Pan (fot. 7 A i B). Silnie dodatnie wybarwienie na CK 19 obserwowano w komórkach JE (fot. 7 C), podczas gdy w OGE dotyczyło to jedynie niewielkiej liczby rozproszonych komórek (fot. 7 D); barwienie na CK 10/13 zarówno w JE, jak i OGE dało wyniki słabo dodatnie lub dodatnie (fot. 7 E, F); ponadto nieliczne rozproszone komórki obu rodzajów wybarwiały się dodatnio na CK 16 (fot. 7 G, H). Kontrole negatywne nie wybarwiały się w żadnym preparacie (fot. 7 I, J).

Obserwacja przylegania komórek JE do skrawków korzenia w mikroskopie TEM

W hodowli mieszanej komórek JE i skrawków korzenia w mikroskopie TEM obserwowano proces przyłączania się komórek JE do powierzchni zębiny. Trzy dni po posianiu komórki były kształtu kulistego i nie wykazywały tendencji do spłaszczania (fot. 8 A); pięć dni później liczba komórek JE na powierzchni zębiny wzrosła i część z nich zaczęła przybierać kształt płaski (fot. 8 B). Po 7 dniach komórki JE były już płaskie, przylegały do zębiny błoną komórkową, ale nie uwidaczniano struktur przypominających błonę podstawną i hemidesmosomy (fot. 8 C). Po 9 dniach w komórkach JE pojawiała się pewna liczba depozytów o dużej gęstości elektronowej przypominających hemidesmosomy przy powierzchni błony komórkowej przylegającej do zębiny (strzałki, fot. 8 D). Po 11-14 dniach liczba komórek na skrawkach korzenia znacznie wzrastała i pojawiały się komórki układające się wielowarstwowo (fot. 8 E). Ponadto duża liczba depozytów o dużej gęstości elektronowej pojawiała się na styku błony komórkowej i zębiny. Ostatecznie powstawały struktury przypominające błonę podstawną i hemidesmosomy (strzałki, fot. 8 F).

DYSKUSJA

JE jako szczególny rodzaj tkanki nabłonkowej ludzkich dziąseł

Podczas badania stwierdziliśmy, że ludzki JE jest zwykłym nabłonkiem warstwowym. Komórki in vivo były jednolitego kształtu, stosunkowo nisko zróżnicowane, bez keratynizacji i rąbków nabłonkowych. Ma to prawdopodobnie związek z ich lokalizacją w głębi rowka dziąsłowego, przyleganiem do powierzchni zęba i rzadkim narażeniem na bodźce zewnętrzne. Natomiast SE i OGE są eksponowane na typowe środowisko jamy ustnej zagłębienia i wykazują typowe cechy komórek nabłonka wielowarstwowego płaskiego. Były one kształtu wielokątnego, ściśle ze sobą powiązane, w warstwie powierzchownej skeratynizowane ze zwartymi rąbkami nabłonkowymi, sięgającymi w przylegającą tkankę łączną, i wyraźnie graniczyły z JE. We wcześniejszych doświadczeniach rąbki nabłonkowe widywano również w JE w razie zaniku dziąseł albo obecności głębszych kieszonek dziąsłowych, co sugeruje, że bodźce zewnętrzne i stany zapalne mogą indukować ich tworzenie się. Co więcej, analizy obrazu wykazały, że JE zajmuje obszar około 1 mm długości, 60 μm szerokości i jest głęboki na 15 do 20 warstw komórek. Wskazuje to, że objętość tkanki JE jest niezwykle mała i jest ona trudna do pobrania, co stanowi jeden z głównych powodów tego, że nabłonek ten jest trudny do zbadania. Ponadto komórki JE i OGE wyizolowano i hodowano in vitro, stwierdzając, że morfologia JE różniła się znacznie od typowych rogowaciejących komórek OGE. Komórki JE wykazywały podobieństwo do fibroblastów tkanki łącznej i różniły się między sobą morfologicznie. Wskazuje to, że JE stanowi unikalny rodzaj słabo zróżnicowanego nabłonka dziąseł.

Analiza wzrostu komórek JE i OGE hodowanych in vitro

Jak widać z krzywej wzrostu, komórki JE wykazywały dłuższy czas trwania fazy adaptacyjnej niż komórki OGE; zajmowała ona połowę cyklu wzrostu. Następnie namnażanie się stale przyspieszało aż do osiągnięcia szczytu, bezpośrednio po czym następowała faza spadkowa. Za to komórki OGE rozpoczynały dłuższą fazę wykładniczą po krótkim okresie inkubacji, po czym następowała stosunkowo powolna recesja. Ponadto czas podwojenia populacji komórek JE był krótszy niż OGE, za to dawały się one pasażować mniej razy niż OGE. Możliwe przyczyny tych różnic mogą być wyjaśnione, jak następuje. In vivo JE znajduje się na dnie rowka dziąsłowego. Jest to środowisko zamknięte, gdzie komórki rzadko ulegają różnicowaniu. Stąd potrzebny jest długi okres inkubacji, by komórki JE przystosowały się do nowego środowiska. Po adaptacji komórki JE zyskują wyjątkową zdolność szybkiego namnażania się i osiągają poziom zahamowania wzrostu po stosunkowo krótkim okresie. Dla porównania, komórki OGE – zawsze stykające się ze środowiskiem zewnętrznym – wykazują wysokie zróżnicowanie i duże zdolności adaptacyjne. Toteż krzywa ich wzrostu ulegała łagodnym zmianom.

Analiza zmienności ekspresji cytokeratyn

Różne CK wykazywały różny stopień ekspresji w komórkach tkanki nabłonkowej ludzkich dziąseł, zależnie od ich lokalizacji w jamie ustnej. W badaniu nie wykazano ekspresji CK 5/6 [22] w warstwie podstawnej żadnego z 3 typów nabłonka dziąseł. Pozytywne wybarwienie warstwy ponadpodstawnej może pochodzić od CK 6 [20]. Jako markery nabłonka jednowarstwowego CK 8 i 18 zwykle nie wykazują ekspresji w nabłonku wielowarstwowym. Bampton i wsp. wykazali, że CK 8/18 nie wykazywały ekspresji w JE, ale stwierdzano je w hodowanych in vitro komórkach nabłonka ludzkich dziąseł [27]. Mackenzie i wsp. podali, że CK 8/18 mogą wykazywać niestałą ekspresję w OGE i SE [20], zaś Pritlove-Carson i wsp,. że ekspresja CK 8/18 w JE wzrasta w stanach zapalnych [3]. W badaniu wykryliśmy ekspresję CK 8/18 we wszystkich warstwach JE, a tylko w warstwie podstawnej OGE i SE (w niektórych próbkach również słabo dodatnią w warstwie ponadpodstawnej). Dane te są zgodne z wynikami Mackenzie i wsp. Wzorzec ekspresji CK 19 był podobny do CK 8/18, lecz CK19 wykazywała wyższy poziom ekspresji, a granica między JE a SE była wyraźnie widoczna z powodu znacznych różnic w wybarwieniu. We wcześniejszych pracach podawano, że CK 19 wykazuje wysoką ekspresję w nowo powstałym JE [22], JE zregenerowanym po zabiegu chirurgicznym [28], nabłonku wewnątrz kieszonek dziąsłowych [20], nabłonku dziąseł objętym stanem zapalnym [21] i hodowanych in vitro komórkach nabłonka z kieszonek dziąsłowych [15]. Może ona posłużyć jako marker nabłonka dziąseł z ciągłym różnicowaniem [8]. Wzorce ekspresji CK 8/18 i 19 potwierdzają, iż JE jest wyspecjalizowanym rodzajem nabłonka, różniącym się od zwykłego nabłonka wielowarstwowego. Podobnie silnie dodatnią ekspresję markera nabłonkowego różnicowania nabłonka CK 19 wykryto również w hodowli komórek JE, co ponadto wskazuje, że komórki JE są w ciągłym stanie różnicowania.

Zaobserwowano także pewne różnice w ekspresji niektórych CK in vitro i in vivo. CK 16 wykazywała ekspresję we wszystkich warstwach JE, ale szczególnie w warstwie ponadpodstawnej OGE [3, 29]. Obserwowano też rozproszone wybarwienie dodatnie zarówno w komórkach OGE, jak i JE. Silnie dodatnią ekspresję CK 10/13 [15, 22, 29] wykryto w warstwie ponadpodstawnej, a ujemną w warstwie podstawnej OGE, podczas gdy in vitro zarówno komórki JE, jak i OGE wybarwiały się słabo dodatnio lub dodatnio. Te różnice mogą być tłumaczone niespecyficznością przeciwciał albo innymi warunkami wzrostu. Dlatego te przeciwciała nie mogą być wykorzystywane dla precyzyjnego odróżniania komórek JE od OGE.

Taki sam wzorzec ekspresji różnych CK w OGE i SE wskazuje, że należą one do tego samego rodzaju nabłonka. Za to OGE i SE różniły się znacząco od JE. Większość CK była powszechnie obecna w komórkach JE (CK 10/13, 16, 19) i wykazywała wysoki poziom ekspresji (CK 5/6, 8/18, 19). Zazwyczaj tkanki albo komórki o niskim stopniu zróżnicowania zdolne są do szybszej proliferacji. Wyjaśnia to szybką regenerację JE. Ponadto, ekspresja CK, takich jak CK 5/6, 8/18, 19 i 20, była szerzej rozpowszechniona i wykazywała wyższy poziom w warstwie ponadpodstawnej (zwłaszcza blisko powierzchni) niż w warstwie podstawnej [30, 31]. Większość CK z silną ekspresją odzwierciedla zarówno wysoką zdolność proliferacji, jak i wysoki poziom zróżnicowania [8, 20, 22, 30, 31]. W konsekwencji tego warstwa ponadpodstawna JE jest słabiej zróżnicowana, lecz bardziej zdolna do regeneracji niż warstwa podstawna. Wydaje się to sprzeczne z biologiczną naturą zwykłego nabłonka, lecz tym silniej obrazuje wyjątkowość biologicznych cech JE. Jednak celem badania było określenie roli wskaźnikowej powyższych CK. Konieczne są dalsze badania nad JE.

Hodowla mieszana komórek JE i skrawków korzenia

W przeszłości prowadzono już badania nad hodowlą mieszaną skrawków tkankowych ludzkiego dziąsła (1 × 1 × 2 mm3) na skrawkach zębiny albo filtrach Millipore [32]. W pierwszym z tych przypadków utworzyły się struktury przypominające hemidesmosomy i błony podstawne pomiędzy skrawkami zębiny i komórkami nabłonka, podobne do występujących naturalnie na styku JE i powierzchni zęba. Nie powstały natomiast takie struktury pomiędzy komórkami nabłonka a filtrem Millipore. Oksanen i wsp. [16] również zaobserwowali dużą liczbę płytek o dużej gęstości elektronowej w miejscu przylegania komórek nabłonka jamy ustnej i skrawków zębiny szczura, gdzie powstawały struktury o wyglądzie hemidesmosomów. JE zazwyczaj przylega do szkliwa szyjki zęba. Gdy dochodzi do uszkodzenia tkanek przyzębia i powstają kieszonki dziąsłowe, JE cofa się w stronę korzenia i tworzy połączenia z powierzchnią zębiny korzenia. Dlatego do naszego badania wybraliśmy skrawki korzenia zamiast skrawków zębiny z korony. W rezultacie wiele komórek przywarło do powierzchni zębiny po 11 dniach hodowli, podczas gdy w takim samym czasie komórki JE wyhodowane na płytce Petriego osiągnęły prawie 100% konfluencji. Toteż podejrzewamy, że przyleganie może być zależne od przygotowania powierzchni podłoża. Powierzchnia płytki Petriego jest gładka, komórki łatwo do niej przylegają i rozpłaszczają się na niej. Natomiast powierzchnia zębiny jest szorstka i nie sprzyja przyleganiu komórek. To podkreśla znaczenie wygładzenia powierzchni korzenia podczas zabiegu skalingu dla ułatwienia regeneracji połączeń komórkowych. W hodowli złożonej pomiędzy 11 a 14 dniem pojawiały się komórki nabłonka wielowarstwowego i zachodziło intensywne tworzenie struktur o wyglądzie hemidesmosomów. Świadczy to o wytwarzaniu się połączeń między komórkami JE a powierzchnią zęba w ciągu około 2 tygodni. Jednakże środowisko in vivo jest bardziej złożone i może na nie wpływać wiele czynników. Na przykład zakażenie powierzchni korzenia i tkanek pod powierzchnią dziąsła może spowalniać tworzenie nowych połączeń. Dlatego też nadal konieczne są badania kliniczne nad JE.

WNIOSKI

JE jest szczególnym rodzajem nabłonka warstwowego o niskim stopniu zróżnicowania i z wysoką zdolnością regeneracji zarówno in vivo, jak i in vitro. W modelu hodowli mieszanej ludzkie komórki JE mogą po około
2 tygodniach wytwarzać struktury w rodzaju błony podstawnej i hemidesmosomów.


Autorzy:
Qian Jiang, Youcheng Yu, Hong Ruan, Yin Luo, Xuehua Guo
Katedra Stomatologii, Szpital Uniwersytecki Zhongshan, Szanghaj, Chiny

Słowa kluczowe:
nabłonek łączący, nabłonek zewnętrzny jamy ustnej, cytokeratyny, badania immunohistochemiczne, hodowla mieszana (kokultura).

Streszczenie:
Celem pracy było zbadanie cech morfologicznych i charakterystyki czynnościowej nabłonka łączącego (JE) i jego komórek w hodowli. Przygotowano wycinki parafinowe ludzkich zębów trzonowych lub przedtrzonowych wraz z otaczającym dziąsłem od strony policzkowo-językowej. W próbkach barwionych HE dokonano analizy wymiarów i porównania różnic morfologicznych między komórkami JE, nabłonka zewnętrznego jamy ustnej (OGE) i nabłonka rowka dziąsłowego (SE).

Konflikt interesów 
Autorzy oświadczają, że nie zachodzi żaden konflikt interesów.

Udział autorów
QJ prowadził molekularne badania genetyczne, hodowlę komórek i analizę in vitro oraz przygotował wstępną wersję pracy. YY i HR brali udział w części histologiczno-morfometrycznej, YL i XG wykonywali badania w mikroskopie TEM. YL uczestniczył w opracowaniu projektu badań i przeprowadził analizę statystyczną. XG opracował koncepcję badań i uczestniczył w ich planowaniu oraz koordynacji. Wszyscy autorzy przeczytali i zatwierdzili ostateczną wersję.

Tłumaczenie
lek. med. Dorota Tukaj
BMC Oral Health 2014, 14:30

Piśmiennictwo:

1. Jiang Q., Li D.: Comparative study on the histomorphology of the JE of human and several laboratory animals. Shanghai Kou qiang Yi Xue = Shanghai
“J Stomatology” 2004, 13(6):539.

2. Willberg J., Syrjänen S., Hormia M.: Junctional epithelium in rats is characterized by slow cell proliferation. “J Periodontol” 2006, 77(5):840-846.

3. Pritlove-Carson S., Charlesworth S., Morgan P.R., Palmer R.M.: Cytokeratin phenotypes at the dento-gingival junction in relative health and inflammation, in smokers and nonsmokers. “Oral Dis” 1997, 3(1):19-24.

4. Newman M.G., Takei H., Klokkevold P.R., Carranza F.A.: Carranza’s Clinical Periodontology. Philadelphia: Elsevier Health Sciences; 2011.

5. Hormia M., Owaribe K., Virtanen I.: The dento-epithelial junction: cell adhesion by type I hemidesmosomes in the absence of a true basal lamina. “J Periodontol” 2001, 72(6):788-797.

6. Schroeder H.E., Listgarten M.A.: The junctional epithelium: from strength to defense. “J Dent Res” 2003, 82(3):158-161.

7. Gursoy U.K., Könönen E., Luukkonen N., Uitto V-J.: Human neutrophil defensins and their effect on epithelial cells. “J Periodontol” 2013, 84(1):126-133.

8. Shimono M., Ishikawa T., Enokiya Y. et al.: Biological characteristics of the junctional epithelium. “J Electron Microsc” 2003, 52(6):627-639.

9. Heymann R., Wroblewski J., Terling C., Midtvedt T., Öbrink B.: The characteristic cellular organization and CEACAM1 expression in the junctional epithelium of rats and mice are genetically programmed and not influenced by the bacterial microflora.“J Periodontol” 2001, 72(4):454-460.

10. Oksanen J. Sorokin L., Virtanen I., Hormia M.: The junctional epithelium around murine teeth differs from gingival epithelium in its basement membrane composition. “J Dent Res” 2001, 80(12):2093-2097.

11. Marchetti C., Farina A., Cornaglia A.I.: Microscopic, immunocytochemical, and ultrastructural properties of peri-implant mucosa in humans. “J Periodontol” 2002, 73(5):555-563.

12. Ishikawa H., Hashimoto S., Tanno M. et al.: Cytoskeleton and surface structures of cells directly attached to the tooth in the rat junctional epithelium. “J Periodontal Res” 2005, 40(4):354-363.

13. Pan Y.M., Firth J., Salonen J., Uitto V.J.: Multilayer culture of periodontal ligament epithelial cells: a model for junctional epithelium. “J Periodontal Res” 1995, 30(2):97-107.

14. Tomakidi P., Fusenig N., Kohl A., Komposch G.: Histomorphological and biochemical differentiation capacity in organotypic co-cultures of primary gingival cells. “J Periodontal Res” 1997, 32(4):388-400.

15. Papaioannou W., Cassiman J.-J., Oord J.V. et al.: Multi-layered periodontal pocket epithelium reconstituted in vitro: histology and cytokeratin profiles. “J Periodontol” 1999, 70(6):668-678.

16. Oksanen J., Hormia M.: An organotypic in vitro model that mimics the dento-epithelial junction. “J Periodontol” 2002, 73(1):86-93.

17. Pitaru S., McCulloch C.A., Narayanan S.A.: Cellular origins and differentiation control mechanisms during periodontal development and wound healing.“J Periodontal Res” 1994, 29(2):81-94.

18. Moll R., Divo M., Langbein L.: The human keratins: biology and pathology. “Histochem Cell Biol” 2008, 129(6):705-733.

19. Mackenzie I., Rittman G., Gao Z., Leigh I., Lane E.: Patterns of cytokeratin expression in human gingival epithelia. “J Periodontal Res” 1991, 26(6):468-478.

20. Mackenzie I., Gao Z.: Patterns of cytokeratin expression in the epithelia of inflamed human gingiva and periodontal pockets. “J Periodontal Res” 1993, 28(1):49-59.

21. Nagarakanti S., Ramya S., Babu P., Arun K., Sudarsan S.: Differential expression of E-Cadherin and cytokeratin 19 and net proliferative rate of gingival keratinocytes in oral epithelium in periodontal health and disease. “J Periodontol” 2007, 78(11):2197-2202.

22. Feghali-Assaly M., Sawaf M., Serres G., Forest N., Ouhayoun J.: Cytokeratin profile of the junctional epithelium in partially erupted teeth. “J Periodontal Res” 1994, 29(3):185-195.

23. Sculean A., Berakdar M., Pahl S. et al.: Patterns of cytokeratin expression in monkey and human periodontium following regenerative and conventional periodontal surgery. “J Periodontal Res” 2001, 36(4):260-268.

24. Jiang Q., Li D.: Cytokeratin expression in human junctional epithelium, oral epithelium and sulcular epithelium. Zhonghua Kou Qiang Yi Xue Za Zhi = Zhonghua Kouqiang Yixue Zazhi = “Chin J Stomatol” 2005, 40(4):298.

25. Kjörell U., Östberg Y., Virtanen I., Thornell L.-E.: Immunohistochemical analyses of autoimmune sialadenitis in man. “J Oral Pathol Med” 1988, 17(8):374-380.

26. Tavakoli M., Bateni E., Attarbashi-Moghadam F. et al.: Comparison of fibronectin in human marginal gingiva and interdental papilla using immunohistochemistry. “Dent Res J” 2011, 8(Suppl1):S109.

27. Bampton J.L., Shirlaw P.J., Topley S., Weller P., Wilton J.M.: Human junctional epithelium: demonstration of a new marker, its growth in vitro and characterization by lectin reactivity and keratin expression. “J Investig Dermatol” 1991, 96(5):708-717.

28. Abe Y., Hara Y., Sakua T., Kato I.: Immunohistological study of cytokeratin 19 expression in regenerated junctional epithelium of rats. “J Periodontal Res” 1994, 29(6):418-420.

29. Feghall-Assaly M., Sawaf M., Ouhayoun J.: In situ hybridization study of cytokeratin 4, 13, 16 and 19 mRNAs in human developing junctional epithelium. “Eur J Oral Sci” 1997, 105(6):599-608.

30. Barrett A., Cort E., Patel P., Berkovitz B.: An immunohistological study of cytokeratin 20 in human and mammalian oral epithelium. “Arch Oral Biol” 2000, 45(10):879-887.

31. Lu Q., Samaranayake L.P., Darveau R.P., Jin L.: Expression of human β-defensin-3 in gingival epithelia.“J Periodontal Res” 2005, 40(6):474-481.

32. Salonen J., Santti R.: An attempt to simulate junctional epithelium of human gingiva in vitro. “J Periodontal Res” 1983, 18(3):311-317.

 

 

 

 

 

 

Przejdź do następnej strony

Nasi klienci