Mikroflora przyzębia i otoczenia implantu u pacjentów z objawami klinicznymi stanu zapalnego tkanek okołowszczepowych i bez takich objawów

Stany zapalne tkanek okołowszczepowych, takie jak periimplantitis albo mucositis, stanowią wyzwanie dla implantologii, będąc – obok warunków obciążenia implantu – jednym z głównych powodów późnych niepowodzeń implantu [1]. Z chwilą wejścia w użycie szerokiego zakresu metod detekcji molekularnej zidentyfikowano ponad 600 gatunków bakterii kolonizujących różne nisze ekologiczne jamy ustnej człowieka [2]. Mikroorganizmy zasiedlające powierzchnie stopniowo organizują się w złożony biofilm. Poszczególne gatunki w obrębie biofilmu oddziałują na siebie wzajemnie. Na przykład „wcześni kolonizatorzy”, jak paciorkowce lub drobnoustroje z rodzaju Actinomyces, są niezbędni, by przyłączyły się Gram-ujemne gatunki „późnych kolonizatorów” [2, 3, 4]. 

Liczne prace objaśniają procesy patogenetyczne z udziałem drobnoustrojów, prowadzące do zakażenia zdrowych tkanek okołowszczepowych. Tworzenie biofilmu wokół implantów charakteryzuje się przesunięciem w składzie mikroflory od przewagi tlenowych i fakultatywnie beztlenowych ziarniaków i pałeczek Gram-dodatnich w kierunku większej proporcji patogenów przyzębia [5- 9]. Jak podają Socransky i wsp. [10], są to Aggregatibacter actinomycetemcomitans, gatunki wchodzące w skład kompleksu czerwonego, jak Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola i Tannerella forsythia, oraz kompleksu pomarańczowego, jak Fusobacterium nucleatum i Prevotella intermedia [11, 12].

Kilka badań skupiających się na patogenach przyzębia wykazało podobieństwa składu mikroflory wokół zębów i implantów. Dlatego też wysuwano wnioski, że zachodzi krzyżowa transmisja drobnoustrojów z zębów do implantów [13-18]. W badaniach tych dla wykrycia potencjalnych patogenów stosowano inne metody, takie jak posiew, hybrydyzacja kwasów nukleinowych, reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR). Jednakże metody te ukierunkowane są tylko na wstępnie określone lub dające się wyhodować filotypy bakteryjne, nie pozwalając na ocenę całej rozmaitości różnorodnych drobnoustrojów w badanym biofilmie [19-22]. Dlatego też nie są one wystarczające do zidentyfikowania potencjalnych różnic w składzie flory bakteryjnej na zębach albo implantach [23]. Szerokozakresowy PCR z amplifikacją genu 16 S rDNA w połączeniu z metodą analizy polimorfizmu konformacji jednoniciowych fragmentów (SSCP) może w sposób niespecyficzny zidentyfikować dominujące gatunki w złożonych populacjach bakteryjnych i bywała już z powodzeniem używana w licznych badaniach nad rozmaitością gatunków flory bakteryjnej [2, 24- 28].

W przeciwieństwie do prac zakładających transmisję bakterii z pozostawionych zębów do implantów nowsze badania znalazły dowody na różnice wzorca kolonizacji. Niektóre badania posługujące się hybrydyzacją DNA-DNA wykazały różnice w liczebności określonych gatunków bakterii na zębach i implantach w różnych fazach tworzenia biofilmu [7, 29, 30]. W innych wokół implantów ze zmianami chorobowymi wykryto specyficzne gatunki gronkowców i bakterii z grupy coli, jakich zazwyczaj nie wiąże się z zakażeniami przyzębia [5, 8, 30, 31, 32]. Heuer i wsp., stosując metodę szerokozakresową, znaleźli różnice w składzie populacji drobnoustrojów wokół zębów i implantów z cechami zapalenia dziąseł albo mucositis, wykluczając całkowitą transmisję z zakażonych zębów do implantów [26]. To badanie posłużyło jako punkt wyjścia do analiz z zastosowaniem szerokozakresowych metod detekcji molekularnej nad różnicami w składzie biofilmu wokół zębów i implantów u osób zdrowych oraz cierpiących na stany zapalne tkanek okołowszczepowych albo przyzębia, aby potwierdzić lub odrzucić hipotezę o braku różnic w składzie mikroflory pomiędzy implantami a pozostałym uzębieniem.

Materiał i metoda

Pacjenci

Na badanie wydała zgodę komisja etyczna Akademii Medycznej w Hanowerze (nr 3791). Każdy pacjent był poinformowany o procedurze ustnie i na piśmie oraz podpisał formularz zgody.

Do badania wybrano 9 osób (8 kobiet, 1 mężczyzna; wiek 21-71 lat, śr. 53 ± 18 lat) z częściowym bezzębiem i zdrową śluzówką jamy ustnej oraz tkankami okołowszczepowymi, oraz 9 osób (5 kobiet, 4 mężczyzn; wiek 42 -71 lat , śr. 58 ± 9 lat) z objawami periimplantitis i zapalenia przyzębia. Wszyscy pacjenci mieli przynajmniej jeden wieloczęściowy implant tytanowy (Astra Tech, Szwecja; Straumann, Szwajcaria) w szczęce lub żuchwie, wszczepiony jednoetapowo w latach 2006-2009 i obciążony najwcześniej w 3 mies. po zabiegu, z koronami albo mostami zacementowanymi na filarze.

Pacjenci zakwalifikowani do badania musieli spełniać następujące kryteria: odbudowa protetyczna w czasie badania (sierpień-październik 2010 r.) obecna od co najmniej pół roku; ostatnie profesjonalne czyszczenie zębów przynajmniej 3 mies. przed badaniem; brak nałogu tytoniowego; brak schorzeń układowych, takich jak cukrzyca, choroby tkanki łącznej, osteoporoza albo białaczka; niestosowanie antybiotyków podczas badania i w okresie 4 miesięcy przed badaniem.

Badanie periodontologiczne

U każdego pacjenta przeprowadzono pełne badanie periodontologiczne, w tym pomiar recesji dziąseł, głębokości kieszonek (PD), ocenę wskaźnika płytki (PI) i krwawienia przy badaniu sondą (BOP). PD i BOP przy każdym zębie i implancie oceniono w sześciu różnych miejscach (mezjalno-policzkowym, policzkowym, dystalno-policzkowym, mezjalno-językowym, językowym, dystalno-językowym). PI oceniono (wg Silness i Loe) w czterech miejscach dla każdego zęba (mezjalnym, dystalnym, językowym i policzkowym).

Głębokość kieszonek przy zębach mierzono znormalizowaną sondą periodontologiczną (WHO-DMS, GY12 DMS, Deppeler SA, Szwajcaria), a przy implantach sondą PP12 DMS (Deppeler SA, Szwajcaria). Ponieważ różnice w nacisku sondy mogą wpływać na wyniki, wszystkie badania kliniczne zostały przeprowadzone przez tego samego wykwalifikowanego lekarza. Głębokość kieszonek została zmierzona z dokładnością do najbliższego milimetra na skali. Uzyskane dane porównywano za pomocą testu t-Studenta, ustalając poziom znamienności na p ≤ 0,05. Z racji wykonywania wielu badań zastosowano korektę Bonferroniego z ustaleniem poziomu znamienności na p ≤ 0,016 (tj. 0,05/3) w przypadku porównania 3 różnych miejsc, a ≤ 0,025 (tj. 0,05/2) w przypadku porównania 2 różnych miejsc.

Pobieranie materiału

U pacjentów bez zmian chorobowych materiał pobrano z okolicy implantu i sąsiedniego zęba; u pacjentów ze zmianami chorobowymi tkanek okołowszczepowych i przyzębia – z okolicy zęba z największą głębokością kieszonki, implantu z największą głębokością kieszonki i sąsiedniego zęba. Zgodnie z kryteriami Amerykańskiej Akademii Periodontologii [33] za objawy choroby przyzębia uznano obecność cech zapalenia, jak zaczerwienie, obrzęk, BOP oraz głębokość kieszonek > 3 mm. Tym samym pacjenci z głębokością kieszonek < 3 mm zostali uznani za wolnych od choroby przyzębia. Dla uzyskania spójnych wyników taką samą procedurę przeprowadzono dla implantów, gdzie zgodnie z Konsensusem VII Europejskich Warsztatów Periodontologicznych [23] za zmiany chorobowe wokół implantu uznaje się obecność BOP lub wysięku ropnego oraz ruchomość implantu, zaś w przypadku braku tych objawów implant jest traktowany jako zdrowy.

Zęby i implanty osuszono strumieniem powietrza, starannie usuwając powłokę śliny, a następnie wacikami bawełnianymi. Następnie w czterech punktach (mezjalno-przedsionkowym, dystalno-przedsionkowym, mezjalno-językowym i dystalno-językowym) umieszczano za pomocą sterylnych kleszczyków, osobnych dla każdego zęba i implantu, cztery sterylne ćwieki papierowe na 10 sekund. Po wyjęciu wszystkie ćwieki razem wkładano do sterylnej probówki 1,5 ml (Eppendorf AG, Niemcy) i przechowywano w temperaturze -80°C do czasu dalszej obróbki. Zarówno pobieranie próbek, jak i pomiary zostały przeprowadzone przez tego samego stomatologa.

Izolacja DNA, amplifikacja 16 S rDNA i nadtrawianie egzonukleazą

W celu ekstrakcji genomowego DNA komórki bakteryjne rozdrobniono mechanicznie za pomocą homogenizatora kulkowego (Precellys® 24, Bertin Technologies, Francja). Uzyskane DNA oczyszczono za pomocą zestawu QIAmp DNA Mini Kit (Qiagen, Niemcy), zgodnie z instrukcją producenta dla DNA bakteryjnego. Wyizolowane DNA przechowywano w temperaturze -20°C do czasu dalszej obróbki. PCR z amplifikacją 16 S rDNA oraz wstępne przygotowanie DNA do analizy SSCP przeprowadzono zgodnie z protokołem, jaki opublikowali Heuer i wsp. [26].

Elektroforetyczna separacja fragmentów 16 S rDNA zgodnie z sekwencją metodą SSCP

Analizę polimorfizmu konformacji jednoniciowych fragmentów (SSCP) wykonano na aparaturze DCode Universal Mutation Detection System (Bio-Rad, USA) w 8-proc. żelu poliakryloamidowym (Biorad) z buforem TBE w stężeniu roboczym 1x. Elektroforezę prowadzono przez 24 godziny w temperaturze 20°C pod napięciem 360 V.

Ekstrakcja, reamplifikacja, sekwencjonowanie

Profil SSCP uwidoczniono poprzez wybarwianie srebrem (Silver-Stain Kit, Biorad, USA), zgodnie z instrukcją producenta, po czym wykonano dokumentację fotograficzną. Prążki wycięto z żelu i eluowano DNA przez 1 noc w buforze elucyjnym (0,5 M octanu amonu, 10 mM octanu magnezu, 1 mM EDTA, 0,1% dodecylosiarczanu sodu; pH 8,0). Eluowany DNA zagęszczono i użyto jako wzorca dla reamplifikacji PCR. Amplikony oczyszczono za pomocą zestawu MinElute PCR Purification Kit (Qiagen, Niemcy) i poddano sekwencjonowaniu przez podwykonawcę (Seqlab w Getyndze, Niemcy). Sekwencje analizowano za pomocą oprogramowania BioEdit (v7.0.9, Ibis Biosciences, USA) i sklasyfikowano taksonomicznie przez porównywanie z sekwencjami z baz danych BLAST i RDB.

Aby sklasyfikować daną sekwencję do poziomu gatunku, wymagana była zgodność minimum 97%. Identyfikacja na poziomie rodzaju została przeprowadzona zgodnie z programem RDB Classifier, z predefiniowanym poziomem odcięcia 80%. Opis filotypów jak dotąd nie w pełni sklasyfikowanych na poziomie rodzaju przeprowadzono zgodnie z bazą danych Human Oral Microbiome Database [34].

Wyliczanie profili SSCP i analiza statystyczna

Do oceny indywidualnych wzorców 16 S rDNA wykorzystano pakiet oprogramowania The Quantity One 1D-Analysis (v4.6.5, Biorad).

Analiza statystyczna porównywała skład populacji bakteryjnej w płynie z rowka dziąsłowego wokół implantów i wokół własnego uzębienia pacjenta, a hipoteza zerowa miała zostać odrzucona, gdyby stwierdzono między nimi znamienną różnicę.

Hipoteza zerowa brzmiała:

• H0 (1): nie ma różnicy w składzie populacji bakteryjnej pomiędzy implantami a własnym uzębieniem pacjenta.

• HA (1): istnieje znamienna różnica w składzie populacji bakteryjnej pomiędzy implantami a własnym uzębieniem pacjenta.

Dla porównania danych użyto testu Wilcoxona dla par. Poziom znamienności ustalono na p ≤ 0,05.  Do przetworzenia danych wykorzystano oprogramowanie SPSS/PC Version 20.0
dla Windows (SPSS, USA).

Porównano również wzorce migracji prążków u poszczególnych pacjentów. Prążki występujące na takiej samej wysokości (± 4%) w żelu uznano za należące do tego samego gatunku bakterii (mała różnorodność), podczas gdy różnice we wzorcach wskazywały na zmianę składu populacji bakteryjnej (duża różnorodność).

Wyniki

Badanie kliniczne 

Porównanie wyników pacjentów zdrowych i cierpiących na zapalenie przyzębia/tkanek okołowszczepowych wykazało statystycznie znamienne różnice w zakresie głębokości kieszonek i BOP (tab. 1).

W grupie pacjentów z objawami chorobowymi (tab. 2) głębokości kieszonek wykazywały znamienne różnice zarówno pomiędzy całym własnym uzębieniem pacjenta (3,6 mm ± 0,7 mm) i wszystkimi implantami (4,8 mm ± 0,5 mm), jak również pomiędzy implantami, z których okolicy pobierano próbki (5,2 mm ± 0,6 mm) i sąsiednimi zębami (3,9 mm ± 1,0 mm). Nie znaleziono natomiast znamiennych różnic pomiędzy zębami z największą głębokością kieszonek (5,6 mm ± 1,5 mm) a implantami, z których okolicy pobierano próbki lub sąsiednimi zębami. Wartości BOP nie różniły się znamiennie pomiędzy całym własnym uzębieniem pacjenta a wszystkimi implantami, ani też pomiędzy poszczególnymi miejscami.

W grupie pacjentów zdrowych (tab. 3) głębokości kieszonek nie różniły się znamiennie pomiędzy całym własnym uzębieniem pacjenta (2,4 mm ± 0,2 mm) a wszystkimi implantami (2,6 mm ± 0,4 mm) ani pomiędzy implantami, z których okolicy pobierano próbki (2,8 ± 0,4), i ich sąsiednimi zębami (2,4 ± 0,5). Wartości BOP również nie wykazywały różnic pomiędzy wszystkimi tymi miejscami.

Separacja fragmentów 16 S rDNA zgodnie z sekwencją

W celu oceny różnorodności populacji bakterii zamplifikowane fragmenty bakteryjnego 16 S rDNA poddano separacji za pomocą SSCP. Fragmenty 16 S rDNA z takim samym wzorcem migracji w żelu przypisano temu samemu gatunkowi bakterii.

W grupie pacjentów zdrowych znaleziono średnio 6,2 ± 3,2 prążków na 1 ścieżkę w materiale pobranym z rowków dziąsłowych wokół implantów i 5,9 ± 2,6 wokół sąsiednich zębów. W grupie pacjentów z objawami chorobowymi odpowiednio: 4,1 ± 2,7 wokół implantów, 5,0 ± 1,8 wokół zębów sąsiadujących i 5,9 ± 3,7 wokół zębów z największą głębokością kieszonek. Różnice te nie były statystycznie znamienne.

W 17 z 27 próbek porównanie indywidualnej migracji prążków w materiale pobranym z różnych miejsc wykazało różnice w składzie populacji bakterii wokół implantów i własnych zębów zarówno u pacjentów zdrowych, jak i z objawami chorobowymi.

Analiza sekwencji

Tab. 4 prezentuje wyniki pełnej analizy sekwencji na poziomie rodzajów i filotypów u pacjentów zdrowych i z objawami chorobowymi. Tab. 5 z kolei wyniki z różnych miejsc pobrania na poziomie gatunku albo filotypu na poziomie gatunku u pacjentów zdrowych i z objawami chorobowymi.

Pacjenci z objawami chorobowymi

U pacjentów z objawami chorobowymi znaleziono ogółem 25 dominujących rodzajów, w tym 13 różnych rodzajów wokół implantów, 14 wokół sąsiednich zębów i 16 wokół zębów z największą głębokością kieszonek. Najczęściej wykrywane rodzaje to: Enterococcus, Streptococcus, Porphyromonas, Fusobacterium, Prevotella, Bacillus i Fretibacterium.

Bakterie z rodzajów Neisseria i Kingella zostały znalezione wyłącznie wokół implantów, podczas gdy Fretibacterium i niesklasyfikowane pałeczki wyłącznie wokół zębów naturalnych (zarówno sąsiednich, jak i z największą głębokością kieszonek). Rodzaje Tannerella, Rothia, Parabacteroides, Parvimonas, Filifactor wykrywano tylko przy zębach z największą głębokością kieszonek, natomiast nie przy implantach albo sąsiednich zębach.

Pacjenci zdrowi

W grupie pacjentów zdrowych znaleziono ogółem 14 dominujących rodzajów, w tym 10 różnych rodzajów wokół zębów własnych i 10 wokół implantów. Najczęściej wykrywane rodzaje to Enterococcus, Bacillus, Streptococcus i Fusobacterium. Rodzaje Veillonella, Capnocytophaga i Leptotrichia były wykrywane tylko przy zębach naturalnych, ale nie przy implantach, gdy tymczasem Prevotella, Porphyromonas, Rothia i Proteus znaleziono tylko wokół implantów.

Wyniki analizy sekwencji pozwalają odrzucić hipotezę zerową, że nie istnieje różnica pomiędzy implantami a własnym uzębieniem pod względem składu flory bakteryjnej.

Dyskusja

W publikowanym badaniu zanalizowano skład flory bakteryjnej zasiedlającej otoczenie zębów naturalnych i implantów zarówno u osób zdrowych, jak i z objawami zapalenia przyzębia/tkanek okołowszczepowych za pomocą metody SSCP, pozwalającej na precyzyjną separację fragmentów 16 S rDNA zgodnie z sekwencją.

W obu grupach pacjentów (zdrowych oraz z objawami zapalenia przyzębia/tkanek okołowszczepowych) znaleziono podobnie bogatą florę bakteryjną we wszystkich badanych miejscach wokół zębów naturalnych i implantów. Wyniki naszego badania różną się od wyników uzyskanych przez Heuera i wsp. [26], którzy stwierdzili znacznie większą rozmaitość flory bakteryjnej wokół zębów z zapaleniem dziąseł niż wokół implantów z cechami mucositis. Ta rozbieżność może po części być wyjaśniona większym nasileniem zapalenia tkanek u obecnie badanych pacjentów. Odmienny skład flory bakteryjnej w różnych siedliskach w obrębie jamy ustnej opisali również Kumar i wsp. [35], którzy stwierdzili znacznie bardziej urozmaiconą florę wokół zębów niż wokół implantów zarówno u pacjentów ze zdrowym przyzębiem, jak i zmianami chorobowymi. Te wyniki można przypisać odmiennej metodzie podejścia do próbek: o ile Kumar i wsp. [35] skumulowali wszystkie próbki z różnych miejsc dla danego pacjenta, w naszej analizie braliśmy pod uwagę osobno próbki pobrane z każdego miejsca.

Wcześniejsze publikacje sugerowały, że mikroflora okolicy implantu nie różni się znamiennie od pobranej z rowka dziąsłowego ani w stanie zdrowia, ani w przypadku zmian chorobowych, skąd wnioskowano, że zachodzi krzyżowe zakażenie okolicy implantu przez przeniesienie drobnoustrojów z otaczających zębów [13-18]. Nasze wyniki nie potwierdzają tej hipotezy. W naszym materiale stwierdziliśmy znacząco mniejsze podobieństwa pomiędzy florą pobraną z różnych miejsc zarówno u osób zdrowych, jak i ze zmianami chorobowymi. Z dużej liczby wykrytych bakterii jedynie gatunki Porphyromonas gingivalis, Enterococcus italicus, Bacillus  sp. takson B77 i Bacillus  sp. takson C43 obecne były we wszystkich miejscach pobierania próbek u pojedynczych osób ze zmianami chorobowymi. U jednego pacjenta bakterie Enterococcus  sp. takson A43 były obecne zarówno przy implancie ze zmianami chorobowymi tkanek miękkich, jak również przy sąsiednim zębie. U kolejnych kilku pacjentów zarówno przy implancie, jak i przy zębie z największą głębokością kieszonek wykryto: Enterococcus casseliflavus, Porphyromonas gingivalis, Bacillus cellulosilyticus i Veillonella  spp. (po jednym gatunku u każdego).

Obecność Porphyromonas gingivalis pozostaje w zgodzie z kilkoma pracami, podającymi, iż ten typowy drobnoustrój z „kompleksu czerwonego” wg Socransky’ego i wsp. [10] wykrywa się w zwiększonej liczebności w przypadkach zapaleń tkanek okołowszczepowych [9, 36, 37]. Jednakże wspomniani badacze stwierdzali w tych sytuacjach także obfitszy wzrost Aggregatibacter actinomycetemcomitans oraz niektórych gatunków z „kompleksu czerwonego”, jak Treponema denticola i Tannerella forsythia, i „kompleksu pomarańczowego”, jak Fusobacterium nucleatum i Prevotella intermedia [11, 12], czego nie potwierdziły nasze obserwacje. U naszych pacjentów z objawami periimplantitis nie wykrywaliśmy w ogóle Treponema denticola ani Aggregatibacter actinomycetemcomitans, a Tannerella forsythia tylko w jednym przypadku. Nasze spostrzeżenia wspierają też prace Koyanagi i wsp. oraz Renverta i wsp. [27, 38], którzy również stwierdzali jedynie skąpy wzrost periodontopatogenów, takich jak Porphyromonas gingivalis, w zmianach zapalnych tkanek okołowszczepowych. Jest to zgodne również z innymi doniesieniami, w których zauważono, że w przypadkach periimplantitis lub niepowodzenia implantów nie zawsze stwierdza się periodontopatogenne szczepy bakterii [16, 39, 40].

Liczne badania wskazywały na istnienie związku pomiędzy periimplantitis a obecnością pałeczek jelitowych [5, 8, 29, 30, 41]. Charalampakis i wsp. [42] wykryli zwiększoną liczbę takich drobnoustrojów u 18,6% spośród 281 pacjentów. Enterokoki są generalne uważane za ważne patogeny pozaszpitalne i szpitalne, których znaczenie przybiera na sile. Nawet jeśli uznaje się je za drobnoustroje o niskiej patogenności, mogą one powodować poważne zakażenia inwazyjne, takie jak zapalenie wsierdzia, dróg moczowych, narządów miednicy i jamy brzusznej, oraz bakteriemię [43]. Badania wykazały, że Enterococcus casseliflavus zasiedla przewód pokarmowy zarówno osób zdrowych, jak i hospitalizowanych i należy do flory powszechnie wykrywanej w kale ludzkim [44]. Enterococcus italicus bywa rozpowszechniony w produktach mlecznych [45]. Możliwe, że jego obecność można wiązać z czynnikami pokarmowymi. Rola enterokoków w tworzeniu biofilmu wokół implantów i ich znaczenie w procesach patogenetycznych wymagają dalszych badań.

Bacillus cellulosilyticus opisywany jest jako należący do drobnoustrojów alkalifilnych, przydatnych do zastosowań przemysłowych i do badań nad enzymami z powodu zdolności wydzielania zasadowych enzymów pozakomórkowych, opornych na wysokie pH i/lub wysoką temperaturę [46]. Jednak do tej pory nie opisano, by ten drobnoustrój, podobnie jak Bacillus sp. takson B77 lub Bacillus bacterium takson C43, odgrywał jakąkolwiek rolę patogenetyczną w periimplantitis.

U pacjentów zdrowych jedynie Enterococcus  sp. takson A43, Streptococcus mitis, Bacillus  sp. takson B77 i Paracoccus  sp. K1-202 wykryto zarówno w otoczeniu implantów, jak i przyległych zębów.

Na podstawie tego badania i danych opublikowanych przez Preza i wsp. 2009 [47] oraz Dabdoub i wsp. [28] wnioskujemy, że skład bakteryjnego biofilmu wokół zębów i implantów najprawdopodobniej jest cechą specyficzną dla miejsca, zatem poszczególne miejsca mogą stanowić oddzielne ekosystemy.

Wykorzystana metoda SSCP jest użytecznym narzędziem do scharakteryzowania złożonych środowisk bakteryjnych pod względem różnorodności i podziału taksonomicznego [48], jako że w prostej hodowli nie udaje się zreprodukować ich rzeczywistej rozmaitości. W porównaniu z innymi metodami biologii molekularnej niewymagającymi posiewu [49], jak specyficzny PCR [50] albo hybrydyzacja DNA-DNA [47, 51], w których można wykrywać tylko określone, wstępnie podejrzewane gatunki bakterii, SSCP nie jest specyficzna gatunkowo i obejmuje wszystkie bakterie obecne w danej próbce. W ostatnich latach pojawiły się metody sekwencjonowania nowej generacji, jak Illumina lub pirosekwencjonowanie, które również mogą być interesującymi narzędziami analizy różnorodności populacji drobnoustrojowych [52, 53]. Niemniej jednak koszty sekwencjonowania są wysokie, a przetwarzanie i ocena danych wymagają dużej mocy obliczeniowej. W tym względzie SSCP jest wciąż metodą z wyboru dla standardowego laboratorium, w którym potrzebna jest duża siła dyskryminacji dla analizy złożonych populacji bakteryjnych.

Genotypowanie bakterii, w tym metodą SSCP, zastosowano już z powodzeniem w kilku podobnych badaniach [24, 25, 26, 54, 55], jednakże liczba prac obejmujących pacjentów z zapaleniami przyzębia albo tkanek okołowszczepowych jest ograniczona [27, 28, 35]. O ile wiemy, nasze badanie jest pierwszym wykorzystywaniem „genetycznych odcisków palców” bakterii dla oceny składu populacji drobnoustrojów zasiedlających otoczenie implantów ze stanem zapalnym tkanek okołowszczepowych, sąsiednich zębów i niesąsiadujących zębów z największą głębokością kieszonek u tych samych pacjentów; potrzebne są jednak dalsze badania dla zdefiniowania roli różnych siedlisk. Badania in vitro już wskazały, że tekstura powierzchni implantu i jego skład mogą wpływać na mikrobiomy okolicy implantów, choć wielkość tego efektu pozostaje kontrowersyjna [25].

Wnioski

Publikowane badanie wykazuje, że mikrobiomy wokół implantów nie wykazują większej różnorodności niż wokół zębów tego samego osobnika. Jednakże wydaje się, że skład mikroflory wokół implantów i zębów jest różny u każdego człowieka. Implanty z cechami periimplantitis nie zawsze są siedliskiem typowych periodontopatogenów. Toteż badania nad stanami chorobowymi o etiologii wielodrobnoustrojowej, takimi jak zapalenia przyzębia i tkanek okołowszczepowych, powinny obejmować nie tylko typowe szczepy periodontopatogenne, lecz także brać pod uwagę dużą odmienność biofilmów i wzajemne relacje pomiędzy ich składowymi.

Identyfikacja poszczególnych drobnoustrojów wchodzących w skład biofilmu tak u osób zdrowych, jak i u pacjentów z zakażeniem tkanek okołowszczepowych ma potencjalnie duże znaczenie dla opracowania strategii profilaktycznych lub leczniczych.

Podziękowania

Badanie otrzymało wsparcie Niemieckiej Fundacji Badań Naukowych (SFB 599 TP D8; PI: M. Stiesch).

Wkład autorów

M.L.J. jest głównym autorem tej pracy. Wykonała kliniczną część badania, dokonała analizy danych mikrobiologicznych i napisała główną część pracy; S.N.S. pracował przy analizie danych mikrobiologicznych i analizie statystycznej; W.H. wystąpił z pomysłem przeprowadzenia badań, zapewnił materiał do badań, nadzorował kliniczną część badania i pisanie pracy; S.N.S., M.S., J.E. i W.H. brali udział w redagowaniu wersji ostatecznej.

Konflikt interesów

Autorzy oznajmiają, że nie zachodzi żaden konflikt interesów.

Tłumaczenie

lek. med. Dorota Tukaj

„Dentistry Journal” 2015, 3(2), 24-42.

Piśmiennictwo:

1. Manor Y., Oubaid S., Mardinger O. et al.: Characteristics of early versus late implant failure: A retrospective study. „J. Oral Maxillofac. Surg.” 2009, 67, 2649-2652.

2. Dewhirst F.E., Chen T. et al.: The human oral microbiome. „J. Bacteriol.” 2010, 192, 5002-5017.

3. Quirynen M., Vogels R.: Clinical relevance of surface characteristics on the formation of plaque on teeth and implants. „Ned. Tijdschr. Tandheelkd.” 2002, 109, 422-429.

4. Li J., Helmerhorst E.J., Leone C.W., Troxler R.F. et al.: Identification of early microbial colonizers in human dental biofilm. „J. Appl. Microbiol.” 2004, 97, 1311-1318.

5. Leonhardt Å., Renvert S., Dahlen G.: Microbial findings at failing implants. „Clin. Oral Implants Res.” 1999, 10, 339-345.

6. De Boever A.L., De Boever J.A.: Early colonization of non-submerged dental implants in patients with a history of advanced aggressive periodontitis. „Clin. Oral Implants Res” 2006, 17, 8-17.

7. Fürst M.M., Salvi G.E., Lang N.P., Persson G.R.: Bacterial colonization immediately after installation on oral titanium implants. „Clin. Oral Implants Res.” 2007, 18, 501-508.

8. Icoforado G.A., Rams T.E., Feik D., Slots J.: Microbial aspects of failing osseointegrated dental implants in humans. „J. Periodontol.” 1991, 10, 11-18.

9. Mombelli A., van Oosten M., Schurch E., Jr. Lang N.P.:
The microbiota associated with successful or failing osseointegrated titanium implants. „Oral Microbiol. Immunol.” 1987, 2, 145-151.

10. Socransky S.S., Haffajee A.D., Cugini M.A. et al.: Microbial complexes in subgingival plaque. „J. Clin. Periodontol.” 1998, 25, 134-144.

11. Hultin M., Gustafsson A., Hallstrom H. et al.: Microbiological findings and host response in patients with peri-implantitis. „Clin. Oral Implants Res.” 2002, 13, 349-358.

12. Van Winkelhoff A.J., Wolf J.W.: Actinobacillus. actinomycetemcomitans-associated peri-implantitis in an edentulous patient. A case report. „J. Clin. Periodontol.” 2000, 27, 531-535.

13. Gouvoussis J., Sindhusake D., Yeung S.: Cross-infection from periodontitis sites to failing implant sites in the same mouth. „Int. J. Oral Maxillofac. Implants.” 1997, 12, 666-673.

14. Gerbaek M.R., Lang N.P., Persson G.R.: Comparisons of bacterial patterns present at implant and tooth sites in subjects on supportive periodontal therapy. I. Impact of clinical variables, gender and smoking. „Clin. Oral Implants Res.” 2006, 17, 18-24.

15. Mombelli A., Nyman S., Brägger U. et al.: Clinical and microbiological changes associated with an altered subgingival environment induced by periodontal pocket reduction. „J. Clin. Periodontol.” 1995, 22, 780-787.

16. Leonhardt Å., Adolfsson B., Lekholm U. et al.: A longitudinal microbiological study on osseointegrated titanium implants in partially edentulous patients. „Clin. Oral Implants Res.” 1993, 4, 113-120.

17. Papaioannou W., Quirynen M., van Steenberghe D.: The influence of periodontitis on the subgingival flora around implants in partially edentulous patients. „Clin. Oral Implants Res.” 1996, 7, 405-409.

18. Quirynen M., Vogels R., Peeters W. et al.: Dynamics of initial subgingival colonization of pristine peri-implant pockets „Clin. Oral Implants Res.” 2006, 17, 25-37.

19. Tonooka Y., Fujishima M.: Comparison and critical evaluation of PCR-mediated methods to walk along the sequence of genomic DNA. „Appl. Microbiol. Biotechnol.” 2009, 85, 37-43.

20. Lau L., Sanz M., Herrera D. et al.: Quantitative real-time polymerase chain reaction versus culture: A comparison between two methods for the detection and quantification of Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis and Tannerella forsythensis in subgingival plaque samples. „J. Clin. Periodontol.” 2004, 31, 1061-1069.

21. Cho J.C., Tiedje J.M.: Bacterial species determination from DNA-DNA hybridization by using genome fragments and DNA microarrays. „Appl. Environ. Microbiol.” 2001, 67, 3677-3682.

22. Kreil D.P., Russell R.R., Russell S.: Microarray oligonucleotide probes. „Methods Enzymol.” 2006, 410, 73-98.

23. Lang. N.P., Berglundh T.: Working Group 4 of Seventh European Workshop on Periodontology. Periimplant diseases: where are we now? – Consensus of the Seventh European Workshop on Periodontology. „J. Clin. Periodontol” 2011, 38, 178-181.

24. Heuer W., Stiesch M., Braham W.R.: Microbial diversity of supra- and subgingival biofilms on freshly colonized titanium implant abutments in the human mouth. „Eur. J. Clin. Microbiol. Infect”. Dis. 2011, 30, 193-200.

25. Grössner-Schreiber B., Teichmann J. et al.: Modified implant surfaces show different biofilm compositions under in vivo conditions. „Clin. Oral Implants Res.” 2009, 20, 817-826.

26. Heuer W., Kettenring A., Stumpp S.N. et al.: Metagenomic analysis of the peri-implant and periodontal microflora in patients with clinical signs of gingivitis or mucositis. „Clin. Oral Investig.” 2012, 16, 843-850.

27. Koyanagi T., Sakamoto M., Takeuchi Y. et al.: Analysis of microbiota associated with peri-implantitis using 16S rRNA gene clone library. „J. Oral Microbiol.” 2010, 24.

28. Dabdoub S.M., Tsigarida A.A., Kumar P.S.: Patient-specific analysis of periodontal and peri-implant microbiomes.
„J. Dent. Res.” 2013, 92, 168S–175S.

29. Renvert S., Lindahl C., Renvert H., Persson G.R.: Clinical and microbiological analysis of subjects treated with Brånemark or AstraTech implants: A 7-year follow-up study. „Clin. Oral Implants Res.” 2008, 19, 342-347.

30. Botero J.E., Gonzalez A.M., Mercado R.A. et al.: Subgingival microbiota in peri-implant mucosa lesions and adjacent teeth in partially edentulous patients. „J. Periodontol.” 2005, 76, 1490-1495.

31. Salvi G.E., Fürst M.M., Lang N.P., Persson G.R.: One-year bacterial colonization patterns of Staphylococcus aureus and other bacteria at implants and adjacent teeth. „Clin. Oral Implants Res.” 2008, 19, 242-248.

32. Rams T.E., Babalola O.O., Slots J.: Subgingival occurrence of enteric rods, yeasts and staphylococci after systemic doxycycline therapy. „Oral Microbiol. Immunol.” 1990, 5, 166-168.

33. Armitage G.C.: Development of a classification system for periodontal diseases and conditions. „Northwest. Dent.” 2000, 79, 31-35.

34. Human Oral Microbiome Database (HOMD). Available online: www.homd.org (accessed on
27 March 2015).

35. Kumar P.S., Mason M.R., Brooker M.R., O’Brien K.: Pyrosequencing reveals unique microbial signatures associated with healthy and failing dental implants. „J. Clin. Periodontol.” 2012, 39, 425-433.

36. Leonhardt Å., Dahlén G., Renvert S.: Five-year clinical, microbiological, and radiological outcome following treatment of peri-implantitis in man.
„J. Periodontol.” 2003, 10, 1415-1422.

37. Shibli J.A., Melo L., Sanchez F. et al.: Composition of supra and subgingival biofilms of subjects with healthy and diseased implants. „Clin. Oral Implants Res.” 2008, 19, 975-982.

38. Renvert S., Roos-Jänsaker A.M., Lindahl C. et al.: Infection at titanium implants with or without a clinical diagnosis of inflammation. „Clinical Oral Implants Res.” 2007, 18, 509-516.

39. Leonhardt Å., Gröndahl K., Bergström C., Lekholm U.:
Long-term follow-up of osseointegrated titanium implants using clinical, radiographic and microbiological parameters. „Clin. Oral Implants Res.” 2002, 13, 127-132.

40. Sbordone L., Barone A., Ciaglia R.N. et al.: Longitudinal study of dental implants in a periodontally compromised population. „J. Periodontol.” 1999, 70, 1322-1329.

41. Kronstrom M., Svenson B., Hellman M., Persson G.R.:
Early implant failures in patients treated with Brånemark System titanium dental implants: A retrospective study. „Int. J. Oral Maxillofac. Implants.” 2001, 16, 201-207.

42. Charalampakis G., Leonhardt Å., Rabe P., Dahlén G.: Clinical and microbiological characteristics of peri-implantitis cases: A retrospective multicentre study. „Clin. Oral Implants Res.” 2012, 23, 1045-1054.

43. Moellering R.C. Jr.: Vancomycin-resistant enterococci. „Clin. Infect. Dis” 1998, 26, 1196-1199.

44. Toye B., Shymanski J., Bobrowska M. et al.: Clinical and epidemiologic significance of Enterococci intrinsically resistant to vancomycin (possessing the vanC genotype).
„J. Clin. Microbiol.” 1997, 35, 3166-3170.

45. Fortina M.G., Ricci G., Mora D., Manachini P.L.:
Molecular analysis of artisanal Italian cheeses reveals Enterococcus italicus sp. nov. „Int. J. Syst. Evol. Microbiol.” 2004, 54, 1717-1721.

46. Nogi Y., Takami H., Horikoshi K.: Characterization of alkaliphilic Bacillus strains used in industry: Proposal of five novel species. „Int. J. Syst. Evol. Microbiol.” 2005, 55, 2309-2315.

47. Preza D., Olsen I., Willumsen T. et al.: Diversity and site-specificity of the oral microflora in the elderly. „Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis.” 2009, 28, 1033-1040.

48. Schmalenberger A., Tebbe C.C.: Profiling the diversity of microbial communities with single-strand conformation polymorphism (SSCP). „Methods Mol. Biol.” 2014, 71-83.

49. Nocker A., Burr M., Camper A.K.: Genotypic microbial community profiling: A critical technical review. „Microb. Ecol.” 2007, 54, 276-289.

50. D’Ercole S., Catamo G., Tripodi D., Piccolomini R.: Comparison of culture methods and multiplex PCR for the detection of periodontopathogenic bacteria in biofilm associated with severe forms of periodontitis. „New Microbiol.” 2008, 31, 383-391.

51. Socransky S.S., Haffajee A.D., Smith C. et al.: Use of checkerboard DNA-DNA hybridization to study complex microbial ecosystems. „Oral Microbiol. Immunol.” 2004, 19, 352-362.

52. Smith D.P., Peay K.G.: Sequence depth, not PCR replication, improves ecological inference from next generation DNA sequencing. „PLoS ONE.” 2014, 28.

53. Siqueira J.F. Jr., Fouad A.F., Rocas I.N.: Pyrosequencing as a tool for better understanding of human microbiomes.
„J. Oral Microbiol 2012”, 4.

54. Groessner-Schreiber B., Hannig M., Dück A. et al.: Do different implant surfaces exposed in the oral cavity of humans show different biofilm compositions and activities? „Eur. J. Oral Sci.” 2004, 112, 516-522.

55. Heuer W., Kettenring A., Stumpp S.N. et al.: The microbial diversity of periimplant biofilms on implant fixed bar- and telescopic double crown attachments. „J. Oral Implantol.” 2013, 39, 648-654.

The peri-implant and oeriodontal microbiota in patients with and without clinical signs of inflammation

Autorzy:

Meike Luise Jakobi
Prywatna Praktyka Stomatologiczna w Hildesheim (Niemcy)
Sascha Nico Stumpp, Meike Stiesch, Jörg Eberhard, Wieland Heuer
Katedra Protetyki Stomatologicznej i Materiałów Biomedycznych, Akademia Medyczna w Hanowerze (Niemcy)

Streszczenie:
Późne niepowodzenia implantu, spowodowane przez zapalenie otaczających tkanek, stanowią problem kliniczny w implantologii. Droga transmisji drobnoustrojów z zębów do implantów nie jest jeszcze dobrze poznana. Dlatego celem badania była analiza wewnątrzosobniczej transmisji bakterii ze scharakteryzowaniem mikrobiomów poddziąsłowych zębów i implantów tak u osób zdrowych, jak i z oznakami zapalenia przyzębia lub periimplantitis. Pobrano próbki płynu z rowków dziąsłowych wokół zębów i implantów.

Summary:
Late implant failures, caused by the inflammation of surrounding tissues are a problem in implant dentistry. The path of bacterial transmission from teeth to implants is not completely understood. Therefore, the purpose of this study was to analyze intraindividual bacterial transmission characterizing subgingival microbiomes in teeth and implants, both in healthy subjects and in those with signs of periodontitis or peri-implantitis. Samples of peri-implant and dental sulcus fluid were collected.