Wykorzystanie densytometru gazowego i spektrofotometru podczerwieni do porównania właściwości korzeni zębów ze szczęki i z żuchwy

Stałe uzębienie człowieka składa się z 32 zębów osadzonych w zębodołach szczęki i żuchwy. Pojedynczy ząb tworzą część koronowa, obecna w świetle jamy ustnej, oraz korzeniowa, pogrążona w kości i w warunkach fizjologicznych odizolowana od środowiska jamy ustnej. Histologicznie składa się ono z czterech tkanek: szkliwa, zębiny, cementu i miazgi. Korona zęba pokryta jest szkliwem. To najtwardsza i najbardziej zmineralizowana tkanka w ludzkim organizmie. Zrąb zęba budujący koronę i część korzeniową stanowi zębina, tkanka o złożonej budowie histologicznej. Pod względem chemicznym jest słabiej zmineralizowana niż szkliwo i zawiera większą ilość komponenty organicznej. Zębina to tkanka bardziej podatna na działanie szkodliwych czynników chemicznych i bardziej elastyczna. W części korzeniowej zęba pokryta jest cementem korzeniowym. Cement, zawierający 60-65% składników mineralnych i 35-40% substancji organicznej, jest najsłabiej zmineralizowaną twardą tkanką budującą ząb. W warunkach zdrowego przyzębia kostniwo jest całkowicie odizolowane od środowiska jamy ustnej. Cement zbudowany jest z warstw narastających koncentrycznie wokół korzenia zęba w miarę starzenia się organizmu. Wyróżnia się dwa rodzaje cementu: bezkomórkowy i komórkowy. Pierwszy, zwany pierwotnym, położony jest wewnętrznie i cienką warstwą otacza cały korzeń. Zbudowany jest z delikatnych blaszek złożonych z cienkich włókien kolagenowych i grubszych włókien Sharpeya. Cement komórkowy, zwany wtórnym, leży zewnętrznie do bezkomórkowego. Blaszki budujące pokłady kostniwa wtórnego zbudowane są z substancji podstawowej i włókien kolagenowych. Zawiera on żywe komórki: cementocyty i cementoblasty. Cementocyty są komórkami cementotwórczymi, zamkniętymi w jamkach, które utraciły już zdolność podziału. Tworzą one warstwę cementotwórczą, zwaną precementem, i położoną najbardziej powierzchownie. 

Komorę i system korzeniowy zęba wypełnia miazga. Jest to tkanka niezmineralizowana, jej zadaniem jest odżywianie zwrot zewnętrznych, odbieranie i przenoszenie bodźców oraz tworzenie pokrywającej ją zębiny. Proces odkładania kolejnych pokładów cementu trwa przez całe życie. Z tego powodu u młodszych ludzi obserwuje się cieńszą warstwę cementu niż u starszych. Narastanie dodatkowych pokładów kostniwa ma miejsce nie tylko w miarę starzenia się organizmu, lecz również w przypadku narażenia tkanki na działanie czynników, takich jak: nacisk, stany zapalne, wybrane choroby ogólnoustrojowe lub genetyczne. Stan, w którym stwierdza się grubą, patologicznie przerośniętą warstwę cementu, nazywany jest hipercementozą [1-6].

Spektrometria podczerwieni to nowoczesna metoda pozwalająca na szybkie określenie składu chemicznego próbki, np. tkanek twardych zęba. Spektroskopia jako dział fizyki i chemii molekularnej zajmuje się badaniem struktur energetycznych cząstek poprzez analizę widm otrzymanych na podstawie detekcji promieniowania elektromagnetycznego emitowanego, pochłanianego lub rozpraszanego przez badany obiekt. Za jej pomocą możliwe jest oznaczenie rodzaju związku chemicznego i jego zawartości w próbce [7, 8, 9].

Densytometria zajmuje się określaniem gęstości substancji. Najstarsza metoda pomiaru została wymyślona w czasach starożytnych przez Archimedesa i dotyczyła określania gęstości ciał stałych w cieczy. Do dnia dzisiejszego opracowano wiele metod pomiaru gęstości. Obecnie jedną z najdokładniejszych metod oznaczania gęstości ciał stałych jest densytometria gazowa. Polega ona na oznaczeniu ilości wypartego gazu przy znanej masie próbki. Środowiskiem jest gaz obojętny chemicznie, o stosunkowo niewielkich cząsteczkach, np. hel 4.0. Przewagą densytometrii gazowej nad pomiarem gęstości ciał stałych w cieczy jest możliwość badania ciał stałych o porowatej strukturze [9].

MATERIAŁY I METODY

Materiał do badań stanowiło 115 zębów stałych usuniętych w Poradni Chirurgii Stomatologicznej Stomatologicznego Centrum Klinicznego Uniwersytetu Medycznego w Lublinie. Wśród próbek znalazły się zęby zdrowe, usunięte z przyczyn ortodontycznych lub protetycznych (21 zębów), korzenie zębów zniszczonych próchnicowo, z martwą miazgą (68 zębów) oraz zęby usunięte z powodu chorób przyzębia (26 zębów). Wśród próbek znalazło się 56 (48,7%) zębów pochodzących ze szczęki i 59 (51,3%) zębów usuniętych z żuchwy. Średnia wieku pacjentów, od których pozyskano próbki, wynosiła 40,5 roku, a wiek mieścił się w przedziale od 9 lat do 77 lat.

Próbki przekazano do laboratorium w Zakładzie Biofizyki Uniwersytetu Medycznego w Lublinie. Przygotowanie do badań polegało na oczyszczeniu z tkanek miękkich i odcięciu części korzeniowej zębów, która stanowiła przedmiot badań. Pierwszy etap badań polegał na wyznaczeniu gęstości próbek przy wykorzystaniu densytometru gazowego Quantachrome Ultrapyc 1200e. Pomiar był wykonywany trzykrotnie w środowisku helu 4.0.

Kolejny etap polegał na wykonaniu analizy spektrofotometrycznej za pomocą urządzenia Thermo Scientific Nicolet 6700 FT-IR Spectrometer z przystawką Smart. W badaniu spektrometrem podczerwieni oznaczano związki chemiczne znajdujące się na powierzchni próbek, czyli w cemencie korzeniowym. Otrzymane widma poddano obróbce komputerowej w programie GRAMS. Następnie na podstawie dostępnej literatury określono przedziały liczb falowych, w których oznaczano związki organiczne i nieorganiczne zawarte w próbkach. W związku ze złożoną chemicznie budową cementu korzeniowego przedziały, które zakwalifikowano do badania, mogą nieznacznie różnić się od typowych wzorców. Analizowano fragmenty widma, w których przedziały różnych związków nie nakładały się na siebie i nie ulegały zniekształceniu.

W badanych próbkach stwierdzono stosunkowo duże ilości węglanów. Związki te występują w postaci wolnej grupy węglanowej CO^2-₃ lub w postaci związanej z kryształem apatytu. Wolne grupy węglanowe oznaczano w przedziale 824-874 cm^-1. Grupy węglanowe wbudowane w apatyt w miejsce grupy hydroksylowej –OH (grupy węglanowe A) widoczne są w analizie spektrograficznej w przedziale zbliżonym do wolnych węglanów, jednak dają one dodatkowe widmo 1395-1436 cm^-1 i w tym przedziale były oznaczane. Grupy węglanowe typu B są wbudowane w kryształ apatytu w miejsce grup fosforanowych PO^3-₄. Analogicznie do węglanów A oznaczano je na podstawie dodatkowego widma obecnego w przedziale 1446-1472 cm^-1. Innym istotnym dla budowy twardych tkanek związkiem nieorganicznym, uwzględnionym w badaniu, były fosforany. Mają one postać grup fosforanowych PO^3-₄ lub kwaśnych fosforanów HPO^2-₄. Związki z tej grupy oznaczano w przedziale 997-1030 cm^-1. W grupie związków organicznych ważną rolę w budowie tkanek zęba odgrywają białka kolagenowe. Na podstawie dostępnej literatury jako marker opisujący frakcję organiczną w badaniach uwzględniono grupy amidowe I i II rzędu. Pierwsze oznaczano w przedziale 1629-1654 cm^-1. Do oznaczenia amidów II rzędu przyjęto przedział 1515-1575 cm^-1 [7-10].

Z powodu różnic w intensywności widm poszczególnych próbek w opracowaniu posłużono się wzajemnymi stosunkami zawartości związków chemicznych obliczonymi na podstawie pola powierzchni pod wykresem w określonych przedziałach liczb falowych. Otrzymane wyniki poddano analizie statystycznej w programie Statistica w wersji 8.0. Wyniki odstające usunięto za pomocą testu Grubbsa. Porównanie badanego materiału ze szczęki i żuchwy wykonano, stosując test U Manna-Whitneya.

WYNIKI BADAŃ

Rys. 1 ilustruje porównanie gęstości w helu w próbkach z uwzględnieniem ich pochodzenia: z kości szczęki lub żuchwy. Wykresy sporządzono na podstawie tabeli 1. Zarówno wartości średnie, jak i zajmowane przez otrzymane wyniki przedziały są do siebie zbliżone. Analiza statystyczna wykazała brak istotnych różnic w wartościach gęstości w helu pomiędzy próbkami pochodzącymi ze szczęki i żuchwy.

Rys. 2-16 ilustrują porównanie badanych związków chemicznych w próbkach, z uwzględnieniem ich pochodzenia z kości szczęki lub żuchwy. Wykresy sporządzono na podstawie tabeli 1. Analiza danych z tabeli 1
i rys. 2-16 wykazała bardzo zbliżoną zawartość poszczególnych związków chemicznych występujących w próbkach pochodzących ze szczęki i z żuchwy. Oceniane ilorazy zawartości badanych związków chemicznych w szczęce i żuchwie miały zbliżoną wartość mediany i zajmowały podobne przedziały liczbowe. Nie oznaczono istotnych statystycznie różnic w zawartości analizowanych związków chemicznych pomiędzy próbkami pochodzącymi ze szczęki i żuchwy.

DYSKUSJA

Pierwszym z analizowanych parametrów była gęstość korzeni zębów mierzona za pomocą densytometru gazowego w helu 4.0. Pomimo różnic w budowie morfologicznej kości szczęki i żuchwy, polegających na odmiennych proporcjach istoty korowej do gąbczastej kości, nie stwierdzono różnicy w gęstości korzeni zębów szczęki i żuchwy. Gęstość fizyczna jest zależna głównie od ilości związków mineralnych zawartych w tkankach korzenia, świadczy zatem w pewnym stopniu o ich wytrzymałości. Dalszy ciąg badań polegał na ustaleniu różnic we wzajemnych stosunkach zawartości związków chemicznych zawartych w badanym materiale. Proporcja zawartości węglanów do fosforanów określana była na podstawie trzech postaci węglanów: wolnych węglanów, węglanów typu A i węglanów typu B. Według Boskeya stosunek ten jest wykładnikiem stopnia dojrzałości i wielkości kryształów apatytu w kości [11]. Michael łączy wytrzymałość tkanki kostnej z wielkością kryształów apatytu (n5). W badaniach własnych dla stosunku zawartości wolnych węglanów do fosforanów pomiędzy zębami pochodzącymi ze szczęki i żuchwy stwierdzono nieznaczną różnicę na korzyść szczęki (średnia ranga 57,45 w stosunku do 53,48) wynoszącą ok. 7%. Różnica ta nie była istotna statystycznie (p = 0,512). Ilorazy zawartości fosforanów do węglanów typu A i B miały zbliżone wartości dla próbek pochodzących ze szczęki i żuchwy.

Parametrem opisującym dojrzałość kryształu apatytu jest, według Bohica, stosunek węglanów do amidów I rzędu [12]. W badaniach własnych nie stwierdzono istotnych różnic dla stosunku węglanów, węglanów A
i węglanów B do amidów I i II rzędu. Świadczy to o jednakowym stopniu dojrzałości kryształów apatytu w cemencie zębów szczęki i żuchwy. Na podstawie literatury jako wskaźnik stopnia mineralizacji tkanki cementu korzeniowego w badanych próbkach przyjęto stosunek zawartości fosforanów do amidów [13]. W badaniach własnych nie odnotowano istotnych rozbieżności pomiędzy badanymi grupami próbek w kwestii różnic stosunku zawartości fosforanów do amidów I lub II rzędu. Świadczy to o zbliżonym stopniu mineralizacji korzeni zębów szczęki i żuchwy. Grupy amidowe reprezentują zawartość frakcji organicznej w badanej tkance cementu korzeniowego. W badaniach uwzględniono pasma widma odpowiadające amidom I- i II-rzędowym. Według Myung Chul Changa wzrost stosunku amidów II- do I-rzędowych wiąże się ze zmianami w strukturze białek tworzących frakcję organiczną tkanki, polegającymi na wzroście liczby wiązań krzyżowych kolagenu [14]. Nie stwierdzono istotnych różnic dotyczących proporcji amidów I- i II-rzędowych w badanym materiale zębowym. Świadczy to o równej liczbie wiązań krzyżowych struktur białkowych kolagenu tworzącego matrix cementu korzeniowego badanych próbek zębowych ze szczęki i żuchwy.

Otrzymane wyniki badań własnych nie wykazały istotnych odmienności dotyczących stopnia mineralizacji tkanki cementu korzeniowego, a także wielkości i dojrzałości kryształów apatytu budujących cement. Ogólna gęstość korzeni zębów szczęki i żuchwy nie różniła się w istotny sposób. Na podstawie wyników badań własnych należy wnioskować, że korzenie zębów szczęki i żuchwy nie różnią się znacząco pod względem właściwości fizycznych i składu chemicznego.

Autorzy:
prof. dr hab. n. med. Mansur Rahnama, dr hab. n. med. Anna Szyszkowska, prof. nadzw.; dr n. med. Piotr Izdebski
Katedra i Zakład Chirurgii Stomatologicznej Uniwersytetu Medycznego w Lublinie
dr hab. n. med. Grażyna Olchowik, prof. nadzw.
Katedra i Zakład Biofizyki Uniwersytetu Medycznego w Lublinie

Słowa kluczowe:
uzębienie stałe, korzeń zęba, spektroskopia, gęstość.

Streszczenie:
Uzębienie człowieka składa się z 32 zębów rozmieszczonych równomiernie w szczęce i w żuchwie. Kości te różnią się od siebie budową anatomiczną i morfologiczną. W pracy porównano korzenie zębów pochodzących ze szczęki i z żuchwy, biorąc pod uwagę gęstość tkanek i zawartość wybranych związków chemicznych. Badania przeprowadzono na 115 próbkach z wykorzystaniem densytometrii gazowej i spektrometrii podczerwieni.

Piśmiennictwo:

1. Łasiński W.: Anatomia głowy dla stomatologów, wyd. 6, Warszawa, wydaw. PZWL 1993.

2. Królikowska-Parsał I., Czerny K., Majewska T.: Ząb, rozwój i morfologia, wyd. 1, Lublin, Wydaw. Cyto s.c. 1995.

3. Zhen-jiang Cheng i wsp.: Enamel distribution, structure and mechanical alterations in col1-caPPR mice molar. „Arch. Oral. Biol.” 2011, 56, 10, 1020-1026.

4. Chu C. i wsp.: Comparison of the microstructure of crown and root dentin by a Canning electron microscopic study. „J. Dent. Sci.” 2010, 5, 1, 14-20.

5. Diekwisch T. G. H.: Developmental Biology of Cementum. „Int. J. Dev. Biol.” 2001, 45, 5-6, 695-706.

6. Bosshard D. D., Selvi T. K.: Dental cementum: the dynamic tissue covering of the Root. „Periodontol.” 2000, 1997, 13, 1, 41-75.

7. Piotr Wychowański i wsp.: Analiza porównawcza szkliwa i zębiny ludzkich zębów prawidłowych oraz nadliczbowych metodą mikrospektroskopii w zakresie średniej podczerwieni. „Dent. Med. Probl.” 2006, 43, 1, 53-57.

8. Sergiu Amarie i wsp.: Nano-FTIR chemical mapping of minerals in biological materials. „Beilstein J Nanotechnol.” 2012;3:312-23..

9. Ahuja S., Jespersen N.: Modern Instrumental Analysis. Elsevier, 2006.

10. Wychowański P. i wsp.: Analiza porównawcza szkliwa, zębiny i cementu metodą mikrospektroskopii w średniej podczerwieni. „Dent. Med. Probl.” 2004, 41, 3, 413-416.

11. Boskey A.: Bone mineral crystal size. „Osteoporos Int.” 2003, 14, 5, 16-20.

12. Raymond Y. Huang i wsp.: Characterization of Bone Mineral Composition in the Proximal Tibia of Cynomolgus Monkeys: Effect of Ovariectomy and Nandrolone Decanoate Treatment, „Bone” 2002, 30, 3, 492-497.

13. Raymond Y. Huang i wsp.: In situ chemistry of osteoporosis revealed by synchrotron infrared microspectroscopy, „Bone”, 2003, 33, 4, 514-521.

14. Myung Chul Chang: FT-IR study for hydroxyapatite/collagen nanocomposite cross-linked by glutaraldehyde, „Biomaterials”, 2002, 23, 24, 4811-4818.